Identificación y evaluación del mecanismo de activación del sistema proacrosina/acrosina en espermatozoides de alpaca (vicugna pacos)

La reacción del acrosoma (RA), es un evento previo a la penetración de la zona pelúcida (ZP) y fusión de membranas durante la fecundación, está gobernado por la activación de proteasas, en especial por el sistema proacrosina/acrosina en mamíferos. La presencia de este sistema ya ha sido previamente descrito en espermatozoides de alpaca por Valdivia et al. (2000); sin embargo, hasta la fecha se desconoce qué sistema de proteasas gobierna la RA en espermatozoides de alpaca ya que recientes estudios en espermatozoides humanos, caninos y bovinos han demostrado que enzimas con actividad tipo tripsina y quimotripsina gobiernan la RA. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de diferentes inhibidores de enzimas tipo tripsina y quimotripsina sobre la RA y la actividad proteolítica en espermatozoides de alpaca, con la finalidad de conocer qué sistema enzimático gobierna al espermatozoide de alpaca. Se evaluó el efecto de tres inhibidores de enzimas semejantes a tripsina: Benzamidina (2, 4 y 6mM), Inhibidor de tripsina de frejol de soya (SBTI) (20, 40 y 60µM), y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (0.6, 0.8 y 1mM); y de un inhibidor de enzimas semejantes a quimotripsina: tosil fenilalanil clorometil cetona (TPCK) (0.25, 0.5 y 1µM). Se encontró que la RA y la actividad proteolítica fue más eficientemente inhibida por benzamidina (4mM) y PMSF (0.6mM), cuando estos fueron añadidos 10 minutos antes de la inducción de la reacción del acrosoma por lisofosfatidilcolina. TPCK no tuvo efecto alguno sobre la RA o la actividad proteolítica individual. Al evaluar los extractos ácidos (EAs) de espermatozoides de alpaca a pH3 en geles de actividad, se observó una gran banda de digestión de 55KDa, que corresponde a proacrosina. Los EAs fueron posteriormente activados con el incremento del pH 3 a pH 8. La activación del sistema proacrosina/acrosina fue evaluada a los 15, 30 minutos, 1, 1.5 y 2 horas de activación en geles de actividad. Se observaron tres bandas de digestión: de 55 KDa que corresponde a la proenzima proacrosina, una banda de 47 KDa que corresponde a α- acrosina y una banda de 39 KDa que corresponde a β-acrosina. Este ensayo reveló que a los 15 minutos el sistema proacrosina/acrosina está activo y que a la hora y media de activación la proenzima está completamente activada. La fusión de membranas acrosomales, la dispersión del contenido acrosomal y la actividad proteolítica de espermatozoide de alpaca está gobernada por el sistema enzimático tipo trispina proacrosina/acrosina. Palabras clave: actividad proteolítica, reacción del acrosoma, inhibidores tipo tripsina, inhibidores tipo quimotripsina, acrosina.--- The acrosome reaction (AR), is an event needed to zona pellucida (ZP) penetration and membrane fusion during fertilization, is controlled by the activation of proteases, especially by the proacrosin/acrosin system in mammals. The presence of that system has been already described by Valdivia et al. (2000); however, to date it is unknown under which system the AR is controlled in alpaca’s sperm even though recent studies in human, canine and bovine sperm have demonstrated that trypsin-like and chymotrypsin-like enzymes controlled the AR. The aim of the present study is to evaluate the effect of different trypsin-like and chymotrypsin-like enzyme inhibitors on AR and individual proteolytic activity on alpaca’s spermatozoa in order to know under which system are the alpaca’s sperm controlled. The effect of three trypsin-like inhibitors: Benzamidine (2, 4 y 6mM), soybean trypsin inhibitor (SBTI) (20, 40 y 60µM), phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) (0.6, 0.8 y 1mM); and one chymotrypsin-like inhibitor, Tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK) (0.25, 0.5 y 1µM) were tested. The AR and the individual proteolytic activity were more efficiently inhibited by benzamidine (4mM) and PMSF (0.6mM), when they were added 10 minutes before AR induction by Lysophosphatidilcoline. TPCK showed no effect on AR and proteolytic activity. Alpaca’s sperm acid extracts (AE) at pH3 were also evaluated on digestion gels, a 55KDa digestion band was observed, it would correspond to proacrosin. AEs were activated by increasing the pH from 3 to 8. The proacrosin/acrosin system activated was evaluated at 15, 30 minutes, 1, 1.5 and 2 hours on digestion gels. Three digestion bands were observed: 55KDa, corresponding to proacrosin, 47KDa corresponding to acrosin-α and 39KDa, corresponding to acrosin-β. This assay reveals that after 15 minutes, the proacrosin/acrosin system is activated and after one hour and a half proacrosin is fully activated. Acrosomal membrane fusion, acrosomal content dispersion and proteolytic activity from alpaca’s sperm are gobernated by an enzymatic trypsin-like proacrosin/acrosin system. Keywords: proteolytic activity, acrosome reaction, trypsin-like inhibitors, chymotrypsin-like inhibitors, acrosin.Tesi