Characterization of a new genetically modified Plasmodium berghei parasite: development of a pre-erythrocyte malaria vaccine

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Humana e Ambiente), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015Malaria is an infectious disease caused by a protozoan parasite of the genus Plasmodium and transmitted to humans and other animals by infected female Anopheles mosquitoes. Although there are five species of Plasmodium that can infect humans, the majority of the deaths are caused by P. falciparum and P. vivax. Unfortunately, there is still no licensed vaccine against malaria. Whole-organism pre-erythrocytic malaria vaccines have been shown to elicit sterile immunity in both humans and rodents. They induce effective CD8+ T cell responses, required for sterilizing immunity in malaria. Nevertheless, current whole-organism pre-erythrocytic malaria vaccination approaches, which rely on the use of human-infective sporozoites, present risks and limitations that cannot be overlooked. According to the 2013 World Health Organization guidelines, a malaria vaccine should be available for use and licensed by 2030, with at least 75% efficacy and capable of protecting against both P. falciparum and P. vivax. Here, we propose a vaccination approach where a genetically modified rodent P. berghei parasite is used as a platform to deliver immunogenic antigens against the two major human infective Plasmodium species: P. falciparum and P. vivax – the PbTriCS parasite. Our results show that PbTriCS development during the sporogonic stage and in vitro hepatic stage is not impaired, having similar infectivity to wild-type parasites. Although our results in C57BL/6J mice have shown a reduced fitness by PbTriCS parasites in establishing an in vivo liver infection, we demonstrated by ELISA assays that this parasite is able to trigger humoral responses against P. falciparum and P. vivax CS peptides. We conclude that PbTriCS has the potential to be a good malaria vaccine candidate as it is able to elicit strong antibody responses against both P. falciparum and P. vivax. Further studies should be pursued to functionally demonstrate the protective capacity of the immune response induced through immunization with PbTriCS.A malária é uma doença infecciosa endémica em 97 países, causada por um protozoário do género Plasmodium e transmitida por um mosquito fêmea do género Anopheles. Existem cinco espécies capazes de causar infecção em seres humanos, P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale e P. knowlesi. Destas, P. falciparum é o parasita predominante no continente africano e é o responsável pelo maior número de mortes. A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que em 2013 a malária foi responsável pela morte de 584 mil pessoas, sendo que destas, 453 mil correspondem a crianças abaixo dos cinco anos.1 4 5O ciclo de vida do parasita da malária inicia-se quando um mosquito infectado se alimenta de sangue num hospedeiro humano, depositando na sua pele centenas de esporozoítos – a forma do parasita residente nas glândulas salivares do mosquito e capaz de infectar o fígado. Os esporozoítos entram rapidamente na circulação sanguínea chegando ao fígado, onde atravessam os sinusoides hepáticos e diversos hepatócitos, até invadirem um hepatócito com formação dum vacúolo parasitóforo, onde o parasita reside durante todo o seu desenvolvimento hepático14. A fase hepática da infeção por Plasmodium é uma etapa obrigatória do seu ciclo de vida, ainda que clinicamente silenciosa. No fígado, o parasita prolifera, diferenciando-se numa forma replicativa, a forma exo-eritrocítica. Em humanos, a infecção por P. vivax ou P. ovale pode dar origem a formas hepáticas dormentes, os hipnozoítos, que podem causar recaídas na doença, meses ou anos após a infecção.4 5 A fase hepática termina com a libertação de vesículas cheias de merozoítos – os merosomas – para a corrente sanguínea.16 Na corrente sanguínea os merosomas libertam os merozoitos que infectam os eritrócitos, iniciando assim o estádio eritrocítico da infeção. 4 16 Os merozoítos infetam os eritrócitos em ciclos de invasão, crescimento intracelular, multiplicação e re-infeção de novos eritrócitos.18 As células-filhas dos merozoítos podem desenvolver-se em formas assexuadas ou sexuadas do parasita. As primeiras continuam o ciclo de invasão e multiplicação nos eritrócitos ao passo que as segundas originam gametócitos. É na fase sanguínea da infecção que a sintomatologia da malária aparece.19 13 Aquando da ingestão de sangue por uma fêmea Anopheles num humano infectado, há a entrada de gametócitos presentes no sangue para o intestino médio do mosquito. Aqui, os gametócitos diferenciam-se em gâmetas, que se fundem, dando origem a um zigoto diplóide que inicia a meiose. Os zigotos transformam-se numa forma móvel, o oocineto que migra e penetra o epitélio do intestino médio do mosquito, onde se transforma numa forma séssil, o oócisto. O oócisto sofre replicação mitótica produzindo esporozoítos, que após a ruptura do oócisto ficam livres na hemolinfa indo invadir as glândulas salivares do mosquito. O parasita está então pronto para iniciar um novo ciclo num novo hospedeiro.19 Atualmente, as medidas de controlo de malária envolvem o controlo do vetor e o tratamento da doença. Infelizmente, não se encontra atualmente licenciada nenhuma vacina contra a malaria, a qual será sempre uma ferramenta essencial para a erradicação desta doença. Em 2013 a OMS lançou orientações em relação ao desenvolvimento / licenciamento de uma vacina para a malária segundo as quais 2030 deverá haver uma vacina contra ambas as espécies P. falciparum e P. vivax e ter pelo 75% de eficácia. Tradicionalmente, as estratégias de vacinação contra a malária incluem: as vacinas pré-eritrocíticas (têm como alvo o esporozoíto e a fase hepática da infeção); as vacinas eritrocíticas (têm como alvo a fase assexuada do parasita no sangue); e as vacinas que bloqueiam a transmissão (têm como alvo os gametócitos/gâmetas do parasita e/ou outros estádios no mosquito).25 As vacinas pré-eritrocíticas são até ao momento as mais promissoras, podendo dividir-se em dois tipos: as de subunidade e as de organismo inteiro. As vacinas de subunidade baseiam-se no uso de uma pequena porção do parasita, uma proteína ou um péptido, para evocar uma resposta imune. Por seu lado, as de organismo inteiro baseiam-se no uso do parasita todo, administrado numa forma atenuada, ou sob o tratamento com antimaláricos. Atualmente, o candidato a vacina mais avançado, e o único que chegou a estudos clínicos fase 3, é uma vacina de subunidade, a RTS,S, que usa a proteína circumsporozoite (CS) de P. falciparum para evocar respostas imunes.32 No entanto, a sua eficácia é de cerca de 30% e diminui ao longo do tempo.33 As vacinas de organismo inteiro mostraram ser as mais eficazes visto que foi possível induzir respostas imunes em roedores e em humanos capazes de prevenir uma infecção subsequente por Plasmodium.27 28 37 Além disso, as vacinas de organismo inteiro são capazes de espoletar respostas imunes mediadas por células T CD8+.38 39 No entanto, as vacinas de organismo inteiro apenas são contra uma espécie de Plasmodium e baseiam-se no uso de esporozoítos capazes de infetar humanos, o que representa riscos e limitações. O PrudêncioLab do Instituto de Medicina Molecular, tem vindo a investigar o uso do P. berghei como uma estratégia de vacinação contra a malária. P. berghei é um dos parasitas de malária em roedores e em trabalhos anteriores ficou provada a sua capacidade de infectar células do fígado humano, bem como a sua incapacidade de se reproduzir em eritrócitos humanos, impedindo-o de causar a doença. Assim, P. berghei é uma abordagem de vacinação mais segura em relação a outros candidatos a vacina préeritrocítica de organismo inteiro. O PrudêncioLab caracterizou um P. berghei geneticamente modificado (GM) que expressa a proteína CS de P. falciparum sob o controlo do promotor UIS4 de P. berghei. Os resultados deste trabalho mostram que este parasita GM é capaz de suscitar uma resposta imune contra uma infeção causada por P. falciparum. Tendo em conta as diretrizes da OMS, o PrudêncioLab criou recentemente um novo parasita P. berghei GM que expressa simultaneamente as proteínas CS de P. falciparum e P. vivax em loci neutros, o parasita PbTriCS. Este projeto de mestrado teve como objetivo a caracterização deste parasita, avaliando a sua capacidade de desenvolvimento e infeção em mosquitos Anopheles, in vitro em células Huh7, e in vivo em ratinhos C57BL/6J. Para concluir, avaliaram-se as respostas humorais contra péptidos das CS de P. berghei, P. falciparum e P. vivax. espoletadas pela imunização com PbTriCS. A primeira parte da caracterização consistiu em avaliar o desenvolvimento do parasita em mosquitos Anopheles. Para tal, contaram-se os números de oócistos no intestino médio e os números de esporozoítos presentes nas glândulas salivares. Comparados os resultados com os de PbGIMO, a linha inicial não-transfetada e caracterizada como correspondendo ao P. berghei selvagem, não foram encontradas diferenças significativas entre parasitas, permitindo concluir então que a inserção de dois genes em loci neutros não tem impacto no desenvolvimento do parasita no mosquito. Procedemos então à análise do movimento de gliding dos esporozoítos numa superfície de vidro, não tendo sido encontradas diferenças significativas no número de círculos relativamente ao PbGIMO e concluíndo também que as 3 CS são expressas no esporozoíto. Na segunda parte do trabalho, caracterizámos o parasita in vitro através da infeção da linha celular de hepatoma humano Huh7. Concluímos, através da de microscopia de imunofluorescência, que PbTriCS possui uma infetividade semelhante a PbGIMO, sendo o seu desenvolvimento normal, às 48 após a infeção. Foi-nos possível também observar que todas as CS estão a ser corretamente expressas. Decidimos então avançar para a caracterização da infeção in vivo em ratinhos C57BL/6J às 46 horas após a infeção tendo-se observado por qRT-PCR uma redução na infeção do fígado por PbTriCS comparativamente a PbGIMO. A análise de secções de fígado por microscopia de imunofluorescência mostrou que esta redução de infeção se deve a um menor número de parasitas no fígado ao invés de um menor desenvolvimento dos mesmos. No entanto, todas as CS estão a ser corretamente expressas in vivo em PbTriCS. Para entender esta observação, realizámos um ensaio de atravessamento celular, tendo-se concluído que o atravessamento por PbTriCS é cerca de 50-60% inferior ao de parasitas PbGIMO. Isto foi indiretamente confirmado pela observação experimental que o número de parasitas PbTriCS capaz de estabelecer uma infeção no fígado de ratinhos C57BL/6J é menor que PbGIMO. Por último, na terceira parte do trabalho, utilizamos o parasita PbTriCS para imunizar ratinhos C57BL/6J e, por ELISA, foi possível concluir que o soro dos ratinhos imunizados possui anticorpos capazes de reconhecer os péptidos das CS de P. berghei, P. falciparum e P. vivax. Em conclusão, apesar do parasita PbTriCS ter uma menor capacidade de estabelecer uma infeção hepática in vivo em comparação com PbGIMO, os parasitas capazes de infetar o fígado não têm o seu desenvolvimento comprometido e expressam corretamente as várias proteínas CS, permitindo que uma imunização com PbTriCS induza a produção de elevados títulos de anticorpos contra a CS de P. falciparum e P. vivax. Embora mais estudos devam ser feitos, nomeadamente ao nível de respostas imunes e de eficácia, podemos concluir que o parasita PbTriCS constitui um bom candidato a vacina contra P. falciparum e P. vivax