Patterns of T cell co-stimulation and co-inhibition in tumor microenvironment conditions, in vitro

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015T cells (helper and cytotoxic) are present within the tumor microenvironment and constitute viable targets for immunotherapeutic approaches against cancer, either by adoptive T cell transfer or by the use of monoclonal antibodies. The activation, differentiation, function and survival of those T cells comprehends a complex process and it is regulated by co-stimulatory and co-inhibitory receptors which modulate the initial T cell receptor (TCR) signal, increasing or hindering their anti-tumor function, respectively. Furthermore, various factors secreted by tumor cells or non-lymphoid stromal cells are believed to mostly downmodulate T cell responses. In this work the patterns of expression of co-signaling molecules on T cells were assessed using peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from healthy donors cultured with transforming growth factor (TGF-β), in order to mimic one of the major immunosuppressive stimuli of the tumor microenvironment. Noteworthy, all herein reported effects of TGF-β were entirely dependent on the subsequent T cell activation by an antibody against the CD3ε chain that is part of the TCR complex. While co-inhibitory receptors such as CTLA4 and PD1 were upregulated, PD-L1, TIGIT and TIM3 (also co-inhibitory) had their expression decreased. The transcription factor FOXP3, associated with the regulatory T cell phenotype, was upregulated by TGF-β. For co-activating receptors, the same condition upregulated 4-1BB, CD30 and CD28 expression, whereas it decreased OX40, ICOS and DNAM1 and did not it interfere with CD27 or LIGHT expression. Moreover, alongside TGF-β and anti-CD3, recombinant proteins, such as 4-1BB or OX40 ligand, were added, in order to simulate potential therapeutic strategies using agonistic 4-1BB or OX40 antibodies. It was shown that even though they could induce expression of co-stimulatory receptors such as OX40, CD27 and CD28, there was also CTLA4, PD-1 and TIGIT upregulation. It seems crucial to unravel the details of the dynamics of the expression of co-signaling molecules on T cells to improve existent immunotherapies and design new approaches able to circumvent the immunosuppressive environment, created not only by tumor or stromal cells, but also by immune cells themselves.No microambiente tumoral, estão presentes linfócitos T (auxiliares ou citotóxicos) e estes constituem alvos viáveis em imunoterapias para o cancro, quer por transferência adotiva de linfócitos T, quer pela utilização de anticorpos monoclonais. A ativação, diferenciação, função e sobrevivência destas células T compreende um processo complexo e é regulada por recetores coestimuladores e coinibidores, os quais modelam o sinal inicial do recetor de células T (TCR), amplificando ou diminuindo a sua atividade antitumoral, respetivamente. Adicionalmente, fatores secretados por células tumorais e do estroma podem contribuir para a supressão das respostas das células T. Assim, o padrão de expressão de moléculas cossinalizadoras dos linfócitos T foi estudado usando células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de dadores saudáveis, colocadas em cultura com TGF-β para mimetizar os estímulos supressivos do microambiente tumoral. Todos os efeitos do TGF-β aqui reportados foram dependentes da subsequente ativação das células T por um anticorpo contra a cadeia ε de CD3, que faz parte do complexo TCR. Enquanto recetores coinibidores como CTLA4 e PD-1 tinham a sua expressão aumentada, PD-L1, TIM3 e TIGIT (também coinibidores) encontravam-se subexpressos. O fator de transcrição FOXP3 (associado ao fenótipo de células T reguladoras) estava aumentado na presença de TGF-β. Já no caso dos recetores coestimuladores avaliados, a expressão de 4-1BB, CD30 e CD28 aumentou nas células T, mas OX40, ICOS e DNAM1 encontravam-se subexpressos. Já CD27 e LIGHT não foram afetados pela adição de TGF-β. Adicionalmente, proteínas recombinantes, ligandos de 4-1BB e OX40, foram adicionadas, na presença de TGF-β e anti-CD3, para a simulação de potenciais estratégias imunoterapêuticas. Concluiu-se que, a diferentes níveis, apesar de se ter conseguido induzir a expressão OX40, CD27 e CD28 nas células T, a expressão de CTLA4, PD-1 e TIGIT estava também aumentada. Revelar os detalhes da dinâmica da expressão de moléculas cossinalizadoras em linfócitos T é crucial para aperfeiçoar imunoterapias existentes e criar novas abordagens capazes de minimizar os efeitos dos estímulos imunossupressivos do ambiente tumoral, criado não apenas pelas células cancerígenas e do estroma, mas também pelas próprias células do sistema imunitário