Embriogénesis somática de olivo (Olea europaea L.) a largo plazo: crioconservación de embriones somáticos y análisis de la estabilidad genética

El olivo constituye uno de los cultivos más antiguos y de mayor relevancia de la cuenca mediterránea, tanto por su importancia económica como por su papel medioambiental. La importancia del olivo justifica el desarrollo de programas de mejora con el fin de resolver algunos de los problemas que limitan la producción de este cultivo. Sin embargo, características tales como su elevado nivel de heterocigosis, bajo nivel de cuajado de fruto, dificultades en la germinación de las semillas o largo periodo juvenil, retrasan de forma importante la obtención de cultivares superiores a través de métodos clásicos de mejora. Esto hace que la mejora dependa en gran medida de la Biología Molecular y la Biotecnología. La aplicación de herramientas biotecnológicas requiere la disponibilidad de un protocolo de regeneración eficiente que permita la obtención de plantas a partir de una sola célula. Al igual que en otras especies leñosas, la embriogénesis somática es el método de regeneración normalmente utilizado en olivo. Cuando se utilizan en programas de mejora, los cultivos embriogénicos deben ser mantenidos durante periodos prolongados de tiempo, mientras se llevan a cabo los ensayos biotecnológicos y los análisis en campo. Sin embargo, el mantenimiento in vitro a largo plazo de cultivos embriogénicos conlleva una serie de inconvenientes tales como el riesgo de pérdida del material por contaminación o error humano, la pérdida del potencial embriogénico o la aparición de variación somaclonal. La crioconservación se considera el único método efectivo y seguro para la conservación a largo plazo de germoplasma vegetal. El objetivo general de esta Tesis ha sido estudiar la aplicabilidad en programas de mejora genética de olivo de la embriogénesis somática a largo plazo y la crioconservación. En una primera fase se evaluó el efecto del mantenimiento a largo plazo de cultivos embriogénicos sobre la eficiencia de la embriogénesis somática y el establecimiento ex vitro de las plantas regeneradas. Para ello se utilizaron diez líneas embriogénicas distintas mantenidas mediante subcultivos repetitivos durante dos y ocho años. Independientemente del efecto del genotipo, que en algunas fases de la embriogénesis somática tuvo una influencia determinante, los resultados obtenidos pusieron de manifiesto un aumento de la tasa de proliferación con la edad de los cultivos así como una alteración del patrón de proliferación, presentando las líneas antiguas un crecimiento más rápido y desorganizado. En las fases de maduración y germinación se observó una disminución de la eficiencia que tuvo como consecuencia un descenso significativo del potencial de regeneración. Aunque en las líneas antiguas se obtuvo un mayor número de brotes por embrión somático germinado, estos fueron significativamente más cortos. Las plántulas obtenidas no presentaron diferencias significativas durante las fases de multiplicación y enraizamiento y fueron transferidas con éxito a condiciones ex vitro. No obstante, los tallos procedentes de las líneas embriogénicas más jóvenes mostraron mayor vigor durante la etapa de elongación, dando lugar a brotes axilares de longitud más elevada. En segundo lugar se abordó la puesta a punto de un protocolo de crioconservación eficiente para embriones somáticos de olivo. Con este propósito, se llevó a cabo una serie de experimentos encaminados a optimizar el método de vitrificación en gota sobre tiras de aluminio, desarrollado para ápices de banana. Los resultados obtenidos permitieron establecer las variables básicas del protocolo. Asimismo se comprobó que las condiciones previas de cultivo determinan la respuesta de los embriones somáticos a la crioconservación, observándose un efecto significativo del método de cultivo, en medio sólido o líquido, y de la fase de crecimiento en la que fueron recolectados los explantos. El método de crioconservación no afectó de forma negativa al proceso de embriogénesis somática en ninguna de las tres líneas testadas. No obstante, el estudio de su aplicabilidad a un número elevado de líneas puso de manifiesto la necesidad de una optimización adicional del mismo, ya que en la mayoría de los casos no se alcanzó el 40% de recuperación del cultivo recomendado. Con este fin se probaron diferentes precultivos con sacarosa. Los mejores resultados se obtuvieron con un tratamiento de 7 días en medio ECO sólido suplementado con sacarosa 0,2 M, con el que se consiguieron tasas de recuperación del cultivo superiores al 40% en el 90% de las líneas testadas. La incorporación al protocolo de crioconservación de este pretratamiento no afectó negativamente al proceso de embriogénesis somática ni al establecimiento ex vitro de las plantas regeneradas. Finalmente, se evaluó el efecto de la embriogénesis somática a largo plazo y la crioconservación sobre la estabilidad de las plantas obtenidas. Para ello, se evaluó la fidelidad al tipo de plantas desarrolladas a partir de líneas embriogénicas distintas mantenidas in vitro mediante subcultivos repetitivos durante dos y ocho años. Las plantas fueron analizadas fenotípicamente, por comparación de diferentes caracteres morfológicos con los de plantas control procedentes de semilla, y genéticamente, utilizando marcadores RAPDs. Todos los parámetros evaluados en el análisis morfológico se vieron afectados de forma significativa por el genotipo y la edad del cultivo. El análisis biométrico puso de manifiesto la existencia de individuos con hábitos de crecimiento variantes. El análisis mediante marcadores moleculares permitió detectar variación genética entre individuos regenerados a partir de la misma línea. Esta diversidad apareció en mayor grado en las líneas mantenidas durante más tiempo. La crioconservación, con o sin tratamiento previo con sacarosa, no dio lugar a la aparición de nuevos fenotipos variantes, ni afectó de forma significativa a ninguno de los parámetros morfológicos testados. El análisis con RAPDs puso de manifiesto la existencia de individuos con variación genética