Production of lipids (for biodiesel) and carotenoids from the yeast Rhodotorula glutinis grown in a bench reactor, in a fed-batch system

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015Desde a sua descoberta e exploração que o petróleo se tornou na força motriz da economia mundial e o principal sustento da sociedade moderna, afetando o quotidiano de centenas de milhões de pessoas em todo o Mundo. Contudo, várias previsões por parte de diversas agências alertam para o esgotamento das suas reservas num futuro próximo pois, uma vez que se tratam de um recurso não-renovável, estas existem em quantidades finitas e não conseguem satisfazer o nível de procura atual porque a sua formação natural à escala humana é tão lenta que as reservas existentes simplesmente são incapazes de aumentar ou ser reabastecidas mais rapidamente do que a taxa a que são extraídas atualmente. Além da disponibilidade, existe também o problema do impacto ambiental da exploração e combustão de combustíveis fósseis, principalmente as emissões de CO2 para a atmosfera que estão estreitamente relacionadas com a poluição e as alterações climáticas. Devido a todos os motivos supramencionados, é urgente encontrar substitutos que satisfaçam as necessidades energéticas mundiais. Entre as diferentes alternativas energéticas existentes, os biocombustíveis representam a opção mais favorável ao meio ambiente. Os biocombustíveis podem ser classificados como primários ou secundários. Os primários utilizam material orgânico que é queimado diretamente na sua forma química natural e não modificada, utilizado principalmente para o aquecimento e a produção de eletricidade. Os secundários utilizam a biomassa processada que existe na forma sólida, gasosa ou líquida e podem ser usados para o transporte e em vários processos industriais. Os biocombustíveis secundários são ainda classificados como biocombustíveis de primeira, segunda e terceira geração. Os biocombustíveis de primeira geração são produtos derivados de culturas alimentares para consumo humano. No entanto, a utilização de terras agrícolas aráveis para a sua produção gera alguma polémica, levando a que muitas agências, particularmente organizações agrícolas e alimentares assim como modeladores económicos questionem o uso desses biocombustíveis, considerando-os como inviáveis. De modo a combater esta controvérsia, a produção de biocombustíveis a partir de biomassa não-comestível tem sido favorecida. Ao contrário dos biocombustíveis de primeira geração, a matéria-prima dos combustíveis de segunda geração provém geralmente de materiais lignocelulósicos não-comestíveis, não competindo com a produção de alimentos, eliminando assim a concorrência com as culturas alimentares. Contudo, estes biocombustíveis não podem ainda ser produzidos economicamente em grande escala, uma vez que a conversão de biomassa lignocelulósica em açúcares para posterior fermentação é um processo complexo, necessitando de equipamentos de produção e de processamento mais sofisticados, mais investimento por unidade de produção e instalações de grande escala. Os biocombustíveis de terceira geração utilizam microrganismos como uma alternativa às fontes agrícolas e animais, particularmente microrganismos oleaginosos (aqueles que têm a capacidade de acumular quantidades significativas de triacilgliceróis como materiais de reserva, e apresentam um teor de lípidos superior a 20% do seu peso seco em biomassa) para produção de biodiesel, não apresentando as desvantagens dos biocombustíveis de primeira e de segunda geração. A maior parte dos trabalhos de produção de biodiesel a partir de microrganismos oleaginosos focam-se na utilização de microalgas autotróficas. Estas crescem mais rápido, apresentam produtividades de biomassa e de lípidos mais elevadas e requerem uma menor área de cultivo comparativamente a culturas vegetais. No entanto, tem-se assistido a uma transição para culturas de microalgas heterotróficas devido a maior facilidade de cultivo e por apresentarem produção mais elevada de ácidos gordos em relação a culturas autotróficas. Outros microrganismos heterotróficos produtores de óleo, nomeadamente bactérias, fungos e leveduras também têm sido considerados como uma fonte promissora de biocombustível. A levedura Rhodotorula glutinis é uma espécie oleaginosa produtora de carotenóides, produtos de reserva com alto valor acrescentado de grande interesse comercial com aplicações nas indústrias d alimentação animal, farmacêutica e cosmética. A produção de biocombustíveis de terceira geração é um processo complexo e caro, pelo que, neste aspeto, não traz vantagem em relação aos combustíveis de 1ª geração. Contudo, a coprodução destes compostos intracelulares em conjunto com os lípidos da biomassa da levedura pode contribuir para reduzir significativamente os custos de produção de biodiesel a partir deste microrganismo. Neste trabalho, a levedura Rhodosporidium toruloides NCYC 921 (anamorfo de Rhodotorula glutinis) foi cultivada num bioreactor de 7 L com um volume de trabalho de 5 L num sistema semi-contínuo com o objetivo de se otimizar a produção de ácidos gordos (para a produção de biodiesel) e de carotenóides. A estratégia geral de cultivo consistiu em dois passos distintos. Numa primeira fase, após o desenvolvimento da cultura de levedura em regime descontínuo, uma solução de nutrientes foi fornecida de modo a prolongar a fase de crescimento da levedura. Na segunda fase, assim que a levedura atingiu a fase estacionária, a solução de alimentação foi substituída por uma solução de glucose concentrada (600 g.L-1) para induzir a síntese de materiais de reserva intracelulares, tais como lípidos e carotenóides. Foram realizados quatro ensaios no total. Cada ensaio durou, em média, uma semana, tendo sido recolhidas, pelo menos, três amostras por dia. Para cada amostra, foram analisados vários parâmetros incluindo a estimativa da concentração de glucose residual por meio de um teste qualitativo utilizando tiras de medição da concentração de glucose, valor de pH e a leitura da absorvência a um comprimento de onda de 600 nm. Outros métodos analíticos incluíram a determinação da concentração de azoto e glucose residuais, teor de lípidos totais e teor e composição em ácidos gordos. A primeira e últimas amostras recolhidas a cada dia também foram analisadas por citometria de fluxo, com o objetivo de detetar, em tempo real, o teor de carotenoides totais, assim como a viabilidade celular analisando a integridade da membrana citoplasmática e o potencial da membrana mitocondrial em simultâneo por medição da fluorescência emitida por células de levedura duplamente coradas com os fluorocromos iodeto de propídio e 3,3’-dihexiloxacarbocianina [DiOC6 (3)], respectivamente. Os dois primeiros ensaios foram realizados a valores de pH constantes. O primeiro foi realizado a pH 5,5, enquanto o pH no segundo ensaio foi alterado para 4,0 com o objetivo de melhorar a produtividade de biomassa e a produtividade em ácidos gordos. A alteração de pH no ensaio II resultou num aumento de 23,08% na concentração máxima de biomassa (119,61 g.L-1) e um aumento de 10,23% da produtividade máxima de biomassa (1,76 g.L-1) em comparação com o ensaio I. No entanto, o teor em ácidos gordos, percentagem total de lipídios e concentração de carotenóides no ensaio II foram menores do que no ensaio I devido a problemas associados à limitação de oxigénio. Para os ensaios III e IV, o pH do meio de cultura foi ajustado a 4,0 durante a fase de crescimento da levedura e, uma vez que a cultura atingiu a fase estacionária, foi novamente ajustado para a 5,0 para promover a acumulação de produtos lipídicos de armazenamento, tais como os carotenóides. A única diference entre os ensaios III e IV foi a utilização de uma turbina adicional adaptada ao eixo do rotor do bioreactor para o ensaio IV, de modo a garantir uma transferência de oxigénio mais eficiente no meio de cultura. O ensaio IV foi o que apresentou os resultados mais satisfatórios, obtendo-se valores mais elevados da concentração de biomassa (154,21 g.L-1), produtividade de biomassa (2,35 g.L-1.h-1), produtividade de ácidos gordos (0,40 g.L-1.h-1), produtividade de carotenóides (0,29 g.L-1.h-1) teor total de carotenóides (0,29 mg.g-1) e percentagem de lípidos totais (41,07%) face aos restantes ensaios.In this work the yeast Rhodosporidium toruloides NCYC 921 was grown in a 7 L bioreactor with a 5 L working volume in a fed-batch system with the aim of optimizing production of fatty acids (for biodiesel purposes) and carotenoids, a high-value added product with commercial interest. Several different cultivation strategies were studied. The first two experiments were performed at constant medium pH. The first fed-batch was carried out at a medium pH of 5.5, while the pH in the second assay was changed to 4.0, with the goal of enhancing biomass productivity and to further improve fatty acid and carotenoids productivities. A dual-stage strategy was used in the third fed-batch cultivation, with the yeast growth phase conducted at pH 4.0 and the stationary phase, where products accumulation occurs, was conducted at pH 5.0. These conditions were kept for the fourth assay, with the exception of an additional impeller adapted to the bioreactor’s rotor shaft in order to improve the oxygen transference in the broth. Assay four achieved the highest biomass concentration (154.21 g.L-1), biomass productivity (2.35 g.L-1.h-1), fatty acid productivity (0.40 g.L-1.h-1), total carotenoid concentration (0.29 mg.g-1), carotenoid productivity (0.29 mg.L-1.h-1) and total lipid content (41.07%), showing that the dual-stage strategy was successful and also that oxygen plays an essential role during the yeast cultivation, particularly in the carotenoid synthesis. Flow cytometry was used to monitor, in real time, total carotenoid content and cell viability (membrane potential and membrane integrity) throughout the yeast cultivations. The data obtained revealed a correlation between carbon source starvation, oxygen deficiency and damaged yeast’s cells