Deciphering the role of inflammation in the organotypic hippocampal slice model of epileptogenesis

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015A epilepsia é uma das mais prevalentes desordens neurológicas em todo o mundo, afetando 0.4-1% da população mundial. De acordo com dados da Organização Mundial de Saúde a epilepsia é responsável por 1% dos encargos com doenças. O termo epilepsia inclui várias desordens neurológicas genéticas e adquiridas que têm em comum a ocorrência periódica e imprevisível de convulsões, isto é, de episódios de atividade neuronal excessiva. Embora estejam disponíveis vários fármacos antiepilépticos, estes não são eficazes em 30% dos pacientes que continuam a sofrer progressão da doença. Torna-se então imperativo encontrar novas terapias que previnam o início e/ou progressão desta desordem. Tradicionalmente a epilepsia tem sido considerada unicamente como uma doença neuronal. No entanto, na última década, vários estudos realizados em modelos animais de epilepsia e em tecido cerebral humano de pacientes com esta desordem demonstraram a influência e a contribuição de processos inflamatórios nos mecanismos de geração e recorrência dos ataques epiléticos. A neuroinflamação pode ser vista como uma resposta imune que têm como objetivo enfrentar uma ameaça que esteja a ocorrer no cérebro. No entanto, a inflamação pode ser tanto prejudicial como benéfica na resolução da lesão. Vários estudos demonstraram que um processo inflamatório ocorre em todos os tipos de epilepsia, mesmo nos tipos sem características da fisiopatologia inflamatória, tal como epilepsia do lobo temporal (TLE). TLE é um dos principais e mais perigosos tipos de epilepsia que afeta a zona do hipocampo. Estudos recentes mostraram que o estado de inflamação crónica nesta doença está de facto associado à morte neuronal, à ativação de células da glia e à expressão de fatores inflamatórios. As células da glia, nomeadamente astrócitos e microglia, têm um papel relevante na inflamação através da sobrexpressão e libertação de mediadores inflamatórios, tais como as citocinas. Estas proteínas possuem efeitos tanto na disfunção sináptica como na excitoxicidade e na morte neuronal que podem contribuir para a alteração da excitabilidade neuronal, levando à epileptogénese. As principais citocinas pro-inflamatórias envolvidas na geração e propagação das convulsões são o factor de necrose tumoral (TNF-α), a interleucina-1β (IL-1β) e a interleucina-6 (IL-6). Este estudo pretende avaliar a evolução dos eventos inflamatórios num modelo in vitro de epileptogénese. O estudo foca-se na morte celular, no estado de activação e morfologia dos astrócitos e da microglia, assim como na expressão das principais citocinas pro-inflamatórias envolvidas na epilepsia. Para realizar estes objetivos foram usadas culturas organotípicas de hipocampo, uma vez que, recentemente foi descrita a ocorrência de atividade epilética espontânea nestas culturas. Estas culturas são extremamente atrativas uma vez que as células se desenvolvem de forma semelhante às células in vivo, e podem ser mantidas por longos períodos de tempo permitindo uma manipulação e avaliação a longo prazo. O processo de corte do hipocampo para obtenção das fatias organotípicas representa um trauma bastante severo com o consequente desenvolvimento de conectividade anormal, que também se encontra descrito em tecido humano de pacientes com epilepsia. Por estes motivos, as culturas organotípicas de hipocampo são consideradas um modelo simples e útil no estudo da epileptogénese. As culturas foram preparadas a partir de ratos Sprague-Dawley com 6-7 dias de vida (P6-7). Todos os ensaios foram realizados em amostras obtidas a 7, 14 e 21 dias in vitro (DIV), de modo a estudar a morte celular e os marcadores de inflamação ao longo do tempo. A morte celular foi avaliada através da captação de iodeto de propídio (PI) e dos produtos de clivagem da α-II Espectrina (SBDP). O PI é um marcador fluorescente com a capacidade de se ligar aos ácidos nucléicos. Deste modo, ao entrar nas células cujas membranas estão danificadas (ou seja, em processo de morte celular) permite observá-las num microscópio de fluorescência. Os SBDP dão indicação sobre o tipo de morte celular que está a ocorrer nas células, uma vez que α-II Espectrina pode ser clivada por protéases envolvidas na morte celular, nomeadamente a calpaína (ativada tanto na necrose como na apoptose) e a caspase-3 (principal caspase ativada na apoptose), dando origem a produtos distintos. A ativação dos astrócitos e da microglia foi analisada por western blot através da expressão de marcadores específicos. Para os astrócitos utilizou-se como marcador a proteína acídica fibrilar glial (GFAP) e para a microglia a molécula de ligação ao cálcio ionizado 1 (Iba1). O ensaio de imunofluorescência, realizado com os marcadores referidos, foi efetuado para avaliar as alterações morfológicas destas células da glia, uma vez que a sua forma é indicadora do seu estado de ativação. Adicionalmente, a expressão de mRNA das citocinas, assim como dos seus receptores, foi quantificada por PCR quantitativo. O ensaio de morte celular por PI mostrou que a região CA1 do hipocampo é a zona mais sensível, o que está de acordo com a literatura. A zona CA1 sofre uma reorganização de conexões neuronais e apresenta uma maior concentração de recetores de glutamato, cuja activação pode conduzir à morte das células. Relativamente à progressão da morte celular, tanto os resultados do PI como os SBDP demonstraram um pico de morte celular a 14 DIV. Este resultado coincide com o início de atividade epiléptica espontânea observada neste modelo e considera-se ser uma consequência destes eventos. Neste trabalho apenas o SBDP resultante da clivagem da α-II Espectrina pela calpaína foi obtido. Não se obtive o SBDP resultante da clivagem da α-II Espectrina pela caspase-3, nem a forma ativa desta mesma caspase. Concluiu-se assim que a morte celular neste modelo ocorre por necrose ou pela via de apoptose não dependente das caspases, uma vez que a calpaína atua em ambos os tipos de morte celular. A expressão do GFAP teve um ligeiro aumento ao longo do tempo, mas sem significado estatístico. No entanto, nas imagens de imunofluorescência pode observar-se a formação progressiva de uma cicatriz glial. Esta cicatriz é caracterizada pela presença de astrócitos com processos longos e entrelaçados a cobrir os neurónios, e tem como função restringir espacialmente a inflamação e o tecido danificado. De facto, a ocorrência de cicatriz glial generalizada, isto é, observável em todas as zonas do hipocampo, coincidiu com o pico de morte celular reportado neste estudo. O western blot indicou uma redução de cerca de 40% na expressão do marcador da microglia (Iba-1), tanto a 14 DIV como a 21 DIV, comparativamente a 7 DIV. O ensaio de imunofluorescência mostrou a ocorrência da morfologia “amoeboid”, característica de microglia activada e com maior expressão de Iba1 apenas a 7 DIV, tendo posteriormente ocorrido uma reversão para a morfologia ramificada, típica de microglia não ativa. A avaliação da expressão dos transcritos das citocinas indicou um aumento progressivo ao longo do tempo, relativamente à IL-1β e TNF-α. A IL-6 aumentou significativamente apenas a 21 DIV. A expressão da maioria dos respectivos recetores das citocinas estudadas também mostrou um aumento significativo a 21 DIV. Apenas o recetor TNFR2 do TNF-α teve um aumento estatístico significativo, o que poderá indicar um aumento de sinalização anti-apóptotica a 21 DIV, explicando a diminuição de morte celular obtida nesse tempo. Neste modelo de epileptogénese, obteve-se uma progressão de eventos inflamatórios com aumento de gliose e de citocinas inflamatórias, coincidente com o desenvolvimento da atividade epilética espontânea. Observou-se a ocorrência de astrogliose progressiva, enquanto a microglia reverteu para um estado inativado ao longo do tempo. Neste trabalho, a ativação da microglia parece estar relacionada com a lesão infligida pelo método de preparação das fatias de hipocampo, uma vez que a microglia atua muito rapidamente em situações de lesão (e também de infeção e/ou inflamação), sendo um dos seus principais papéis eliminar os restos celulares resultantes da morte das células. A ativação da microglia é também responsável por promover a ativação dos astrócitos, que representam neste modelo a fonte principal de produção dos mediadores inflamatórios, sendo assim responsáveis por perpetuar o estado de inflamação na epileptogénese. Este trabalho mostrou que o modelo de epileptogénese usado é bastante útil para explorar as funções das células da glia e da inflamação na epileptogénese e na progressão da epilepsia.Epilepsy is one of the most common neurological disorders. The influence of inflammatory processes on epilepsy has increased in the last decade and recent studies show the contribution of astrocytes and microglia for the mechanisms of seizure onset and recurrence, through the overproduction and release of pro-inflammatory cytokines. The aim of this study was to explore the progression of inflammatory markers within the organotypic hippocampal slice model of epileptogenesis. An evaluation of cell death was performed through Propidium Iodide uptake assay and alphaII-Spectrin cleavage. Astrogliosis and microglia activation were also assessed by western blot and by immunofluorescence assays, which used specific markers for astrocytes and microglia, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and ionized calcium-binding molecule 1 (Iba1), respectively. Additionally, the transcript expression of the principal pro-inflammatory cytokines, involved in seizure generation and propagation (IL-1β, TNF-α and IL-6) and their receptors, was achieved through qPCR. All assays were carried out in slices with 7, 14 and 21 days in vitro (DIV). The majority of cell death was obtained in 14 DIV slices, which coincided with the onset of seizure-like activity in this model. Concerning glia activation, an upregulation of GFAP, with glial scar formation, was observed throughout culture time, while microglia changed from an activated amoeboid form to a resting ramified state. Transcript analysis of all pro-inflammatory cytokines revealed an increased expression over time in culture. However, statistical significance was solely achieved in 21 DIV slices. IL-1R1, TNFR2, and IL-6R expression were also upregulated in 21 DIV slices, while TNFR1 levels remained unchanged through time in culture. The results indicate an activity dependent inflammatory process, since at 21 DIV, when slices depict mixed interictal and ictal-like events, an upregulation of inflammatory mediators was observed in the organotypic model of epileptogenesis. More specifically, gliosis and increased expression of inflammatory mediators was achieved