Role of Arl13b-exocyst interaction in ciliogenesis

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014Os cílios primários são organelos sensoriais expostos à superfície da maioria das células eucarióticas. Estes funcionam como estruturas semelhantes a antenas, detectando e transmitindo sinais químicos provenientes do ambiente extracelular para o interior da célula. A sua correcta formação e funções sensoriais são fundamentais para o adequado desenvolvimento embrionário e pós-natal, bem como para a homeostase dos tecidos no adulto. De facto, diversas doenças humanas, conhecidas por ciliopatias, devem-se a defeitos no cílio primário. Este organelo é constituído por um axonema que se forma a partir do corpo basal, originado pelo centríolo-materno da célula, e uma membrana ciliar que encerra uma pequena porção do citoplasma designado por ciliopasma. A membrana ciliar e a membrana plasmática são topologicamente contínuas mas diferem na sua composição lipídica. A membrana ciliar contém vários receptores de sinalização celular, canais iónicos e proteínas de transporte que tornam este organelo numa autêntica antena celular. Até ao momento, ainda não é totalmente conhecido o conjunto de proteínas que regula o processo de montagem do cílio. Várias pequenas proteínas G da superfamília Ras foram implicadas neste processo. Estas proteínas são conhecidas por regularem as vias de tráfego intracelular, assegurando o transporte correcto de moléculas entre compartimentos delimitados por membranas. O cílio primário é um desses compartimentos, e é sabido que as proteínas ciliares são transportadas do citoplasma até ao cílio através destas vias de tráfego intracelular, uma vez que este organelo não possui maquinaria para realizar a síntese proteica. Em particular, proteínas da família “Arf-like” (Arl) tais como a Arl3, Arl6 e Arl13b foram associadas ao cílio primário. Mutações nestas proteínas causam distrofia e disfunção renal, obesidade, polidactilia, entre outros defeitos característicos de ciliopatias. O nosso grupo descobriu recentemente que a Arl13b tem um papel na regulação de tráfego endocítico de reciclagem. Por outro lado, mutações do gene que codifica a Arl13b provocam síndrome de Joubert, uma ciliopatia caracterizada por defeitos neurológicos. Em ratinhos, a mutação de Arl13b causa letalidade embrionária devido a falhas na via de sinalização “Sonic Hedgehog”, presumivelmente causadas por anomalias na estrutura dos cílios primários. Dado que uma das vias que as proteínas ciliares utilizam para chegar ao cílio depende do tráfego endocítico de reciclagem, os nossos resultados que sugerem um papel da Arl13b na regulação desta via poderão contribuir para explicar os defeitos no cílio primário que advêm de mutações na Arl13b. Sendo assim, é possível que a Arl13b tenha um papel no endereçamento/ancoragem de vesículas endocíticas de reciclagem, transportando proteínas ciliares para a região periciliar. Para além disso, é sabido que as proteínas G quando estão no seu estado activo ou ligadas a GTP efectuam as suas funções ligando-se a proteínas designadas por efectores. O nosso grupo obteve evidências sólidas de que Arl13b interage com o exocisto, através da sua subunidade Sec8. O exocisto é um complexo formado por oito subunidades que participa na ligação e ancoragem de vesículas provenientes da rede trans-Golgi e do compartimento endocítico de reciclagem. Recentemente, a subunidade Exo84 do exocisto foi identificada como mutada em pacientes de síndrome de Joubert e através da subunidade Sec10 foi comprovado que o exocisto está envolvido na formação de cílios. Sendo assim, colocámos como hipótese que o papel da Arl13b no tráfego de proteínas ciliares para a região periciliar ocorra através da sua interação com o exocisto. Desta forma, o nosso objectivo é estudar o papel da interacção entre Arl13b e o exocisto na ciliogénese e no tráfego ciliar. O nosso primeiro objectivo foca-se na caracterização da interação entre Arl13b e Sec8. O segundo objectivo concentra-se no papel da interação Arl13b-exocisto na formação de cílios. Os nossos resultados provam que o Sec8 é uma efector da Arl13b, uma vez que a ligação entre as proteínas aumenta na presença de GTP, em linhas celulares de mamífero e que esta interação é independente da presença de cílio. Mostramos também através da síntese in vitro de Arl13b-FLAG e Sec8-Myc que a interação entre estas proteínas é directa e que não necessita da presença das outras subunidades do complexo. Para além disso, observamos também que tanto o domínio N-terminal como o C-terminal da Arl13b são necessários para garantir que esta interação ocorra, uma vez que o domínio N-terminal é responsável pela ligação ao efector e o domínio C-terminal é responsável por estabilizar a proteína e garantir a alteração entre a forma activa e inactiva da mesma garantido a troca entre GTP e GDP. São necessários mais estudos para determinar que região da Arl13b é responsável pela viabilidade da interação com o exocisto, sendo para isso necessário produzir novos plasmídeos de Arl13b com deleções mais pequenas e com mutações pontuais para que a conformação da proteína quando expressa nas células não sofra alterações tão drástica e seja possível determinar a região de interação. Vimos também que outra subunidade do exocisto, o Exo70, é co-immunoprecipitada com Arl13b. Este resultado levanta uma nova hipótese em que o Sec8 medeia a interação entre a Arl13b e todo o complexo exocisto. Por ultimo, mostramos também pela primeira vez que o Sec8 é necessário para a correta ciliogénese, uma vez que ao silenciarmos o Sec8 obtemos uma redução na percentagem de células ciliadas . Este fenótipo não é tão acentuado como o observado aquando do silenciamento da Arl13b mas permite especular que as duas proteínas possam estar envolvidas na mesma via de transporte de proteínas necessárias para a correta formação do cílio. Este resultado reforça a ideia de que a Arl13b é uma peça chave na formação e manutenção da correta biologia ciliar. Um colaborador deste projeto observou uma interação genética sinérgica entre a Arl13b e Sec10 indicando que estas proteínas participam num via comum ou paralela. Em conclusão, com os resultados apresentados neste trabalho, com as informações obtidas a partir do nosso colaborador e com o facto de que Arl13b regula o tráfego endocítico de reciclagem, nós propomos um modelo onde a Arl13b e o exocisto estão envolvidas no transporte de proteínas ciliares originárias do compartimento endocítico de reciclagem até ao interior do cílio. No nosso modelo, o processo baseia- se em dois passos: o Sec8 numa primeira fase é responsável pela seleção e transporte de vesículas contendo Arl13b até à região periciliar; numa segunda fase Exo70 é responsável pela fusão dessas vesículas com a membrana ciliar permitindo a libertação das proteínas ciliares no cilioplasma. Mais estudos são necessários para testar esta hipótese e comprovar o modelo proposto. Os resultados aqui apresentados e os estudos futuros propostos irão fornecer a base para melhor compreender e interpretar a pleiotropia fenotípica e etiologia do síndrome de Joubert.Primary cilia are sensory organelles present on nearly every eukaryotic cell. Arl13b belongs to the Arf family of small G proteins. Mutations in this protein were identified in patients with Joubert syndrome, a ciliopathy characterized by neurological defects combined with polydactyly and cystic kidneys. Nevertheless, the precise role of Arl13b in ciliogenesis remains elusive. We found that Sec8, a subunit of the exocyst, interacts with Arl13b. The exocyst is an octameric complex involved in the tethering of post-Golgi vesicles at their site of fusion, and it has been shown to be required for cilia formation. Interestingly, it was identified in a family with Joubert syndrome amutation in one of the subunit of the exocyst. Furthermore we show that Sec8 is a bona fide effector of Arl13b, since it binds only to the activated form of Arl13b, and that the interaction is direct. We proved that both the N- and C- terminal of Arl13b are required for the interaction with Sec8. Moreover, we found that Exo70, another subunit of the exocyst, also co-immunoprecipitates with Arl13b, suggesting that Sec8 mediates the interaction of Arl13b with the exocyst complex. Regarding the ciliogenesis defects, we show for the first time that silencing of Sec8 causes an abrogation in cilia formationTogether, these results suggest that Arl13b and exocyst function together in the same pathway during ciliarelated processes leading to functional cilia. Since we and others found that Arl13b are involved in endocytic recycling trafficking form the endocytic recycling compartment, it is possible that both proteins work together in the transport of recycling vesicles containing ciliary proteins from the endocytic recycling compartment toward primary cilia