Functional Analysis of Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi Type III Secretion System Effectors

Los efectores (T3E) del sistema de secreción tipo III (T3SS) son factores de virulencia esenciales en la interacción de bacterias fitopatógenas con sus hospedadores, debido a que: (i) promueven la penetración y permanencia del patógeno en el tejido del hospedador, (ii) interfieren con las respuestas de defensa de las plantas y (iii) facilitan el acceso a los nutrientes, promoviendo la proliferación y el crecimiento del patógeno (Gohre and Robatzek, 2008). La secuenciación y análisis de los genomas de diferentes cepas pertenecientes al complejo Pseudomonas syringae, ha permitido identificar el catálogo de T3E hipotéticos de cada una de ellas, así como clasificarlos en más de 60 familias génicas que constituyen el pangenoma de este relevante complejo de bacterias fitopatógenas (http://www.pseudomonassyringae.org/) (Baltrus et al., 2011; Lindeberg et al., 2012). Aunque la función concreta de la mayoría de los T3E identificados hasta la fecha en la interferencia con los mecanismos de defensa de la planta es aún desconocida, durante los últimos años se han producido grandes avances en el conocimiento del papel de los T3E del complejo P. syringae durante la interacción con plantas herbáceas. Estudios recientes, han establecido a Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 como una cepa modelo en el estudio de la interacción de este complejo bacteriano con plantas leñosas (Ramos et al., 2012). El análisis bioinformático del borrador del genoma de esta cepa identificó 33 posibles T3E (Rodriguez-Palenzuela et al., 2010; Ramos et al., 2012), cuya translocación a través del T3SS se demostró para 7 de ellos (AvrRpm2, HopA1, HopAA1, HopAZ1, HopBK1, HopBL1 y HopBL2) durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral (Matas et al., 2014). Además, la secuenciación de los tres plásmidos de esta cepa reveló que los genes codificantes de los T3E HopAF1 y HopAO1 se localizan en los plásmidos pPsv48A y pPsv48B, respectivamente, codificándose en el cromosoma un homólogo de HopAF1 (HopAF1-2). Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo principal que se planteó en esta Tesis Doctoral fue el análisis funcional de los T3E de NCPPB 3335, prestando mayor atención a las familias HopAF y HopAO. Para llevar a cabo este objetivo general, se plantearon los siguientes abordajes: 1) estudiar la distribución de los efectores de las familias HopAF y HopAO en los patovares de P. savastanoi y P. syringae, 2) analizar la translocación a través del T3SS de NCPPB 3335 y el papel en virulencia de los efectores de las familias HopAF y HopAO y, 3) analizar la interacción con los sistemas de defensa de la planta de los siete efectores de NCPPB 3335 cuya translocación a través del sistema de secreción tipo III ha sido demostrada, así como de los pertenecientes a las familias HopAF y HopAO. El análisis bioinformático y filogenético de las familias HopAF y HopAO permitió identificar que ambas se encuentran ampliamente distribuidas dentro del complejo P. syringae, si bien, P. savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 codifica dos genes de la familia hopAO (hopAO1 y hopAO2) y tres genes de la familia hopAF (dos copias del gen hopAF1 y una del gen hopAF1-2). La filogenia de esta última familia reveló que el alelo hopAF1 se codifica mayoritariamente en cepas patógenas de plantas leñosas. Análisis de translocación y transcripcionales validaron a los T3E HopAF1, HopAF1-2, HopAO1 y HopAO2 como nuevos T3E del secretoma del T3SS de NCPPB 3335. Por otra parte, en este trabajo hemos demostrado que tanto los T3E AvrRpm2, HopBK1, HopBL1, HopBL2, HopAF1, HopAF1-2, HopAO1 y HopAO2, así como los efectores truncados HopAA1 y HopAZ1, interfieren con la respuesta de defensa primaria (PTI) de Nicotiana tabacum. Además, presentamos evidencias de que HopAZ1, HopBL1, HopAF1-2, HopAO1 y HopAO2 también inhiben la inmunidad mediada por efectores (ETI) en este mismo hospedador. Por otro lado, y utilizando fusiones traduccionales a la proteína verde fluorescente (GFP), hemos podido comprobar que los T3E HopAF1, HopAF1-2, HopAO1 y HopAO2 se localizan en la membrana plasmática de las células de Nicotiana benthamiana, así como que HopAO2 también se localiza en vesículas del aparato de Golgi. Con el fin de averiguar el papel de los T3E HopAF1 y HopAO1 en la virulencia de NCPPB 3335 se construyeron mutantes simples de los mismos. La deleción del gen hopAF1 del plásmido pPsv48A en NCPPB 3335 tuvo como consecuencia una ligera reducción en el tamaño de los tumores inducidos por este patógeno en plantas de olivo lignificadas, mientras que la deleción del gen hopAO1 conllevó una clara disminución de la virulencia del mismo. Los resultados incluidos en esta Tesis Doctoral, convierten a NCPPB 3335 en la cuarta cepa del complejo P. syringae cuyo secretoma del T3SS incluye un mayor número de T3E demostrados, y en la primera cepa aislada de un hospedador leñoso