Drug delivery of methyl-carboxilated 5-fluorouracil by means of human serum albumin microcarriers

Tese de mestrado integrado em Engenharia Biomédica e Biofísica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2014De acordo com as estatísticas da Organização Mundial de Saúde, o cancro é a segunda causa de morte em todo o mundo, provocando 7,565 milhões de mortes por ano. As últimas décadas têm sido férteis no aparecimento de novos tratamentos para o cancro, muito devido aos nefastos efeitos secundários que os tratamentos tradicionais infligem aos doentes. Muitos desses avanços têm sido possibilitados pelo crescente conhecimento dos processos fisiopatológicos e bioquímicos característicos do aparecimento e desenvolvimento do cancro. O processo de permeabilidade e retenção aumentadas (PRA) (do inglês “Enhanced Permeability and Retention”- EPR) é um dos poucos processos característico dos tumores sólidos que impulsionou o desenvolvimento de uma nova abordagem no campo da quimioterapia. A teoria do PRA postula que a captação e acumulação de macromoléculas biocompatíveis está aumentada nos tumores, muito devido ao desenvolvimento deficiente da sua vasculatura e sistema linfático e da síntese aumentada de mediadores de permeabilidade. A albumina é uma das referidas macromoléculas que são preferencialmente acumuladas nos interstícios dos tumores e no interior das suas células. Esta proteína encontra-se em maioria na porção proteica do plasma sanguíneo, perfazendo um total de cerca 50-70% das proteínas em suspensão no plasma e apresentando um período semi-vida de cerca de 19 dias. A albumina, que pode ser degradada intracelularmente, torna-se então numa fonte de azoto e energia para as células tumorais, que têm necessidade aumentada de energia e nutrientes devido à sua divisão desregulada. A albumina começa por transpor as paredes dos vasos por transcitose mediada pela proteína gp60 que se encontra à superfície de algumas células epiteliais. Quando se encontra na proximidade de células tumorais há um reconhecimento da albumina por proteínas membranares e a proteína é endocitada e subsequentemente degradada no interior de lisossomas. A albumina liga-se a uma grande variedade de ligandos endógenos tal como ácidos gordos não-esterificados e a bilirrubina em múltiplos locais da sua estrutura. Algumas substâncias activas comuns são também ligadas à albumina em condições fisiológicas, tal como o ibuprofeno, diazepam, varfarina e o 5-fluorouracilo (5-FU). No que diz respeito à ligação do 5-FU à albumina, esta foi descrita como sendo de baixas afinidade e especificidade em comparação com outras substâncias tais como o diazepam. O 5-FU é uma droga utilizada no tratamento de cancro, nomeadamente da mama e cólon, e está em prescrição clínica há mais de 50 anos. Esta substância análoga das pirimidinas tem-se afirmado como uma droga antineoplásica relativamente bem sucedida. No entanto o rácio entre a dose eficaz e a dose tóxica é pequeno, ou seja, uma resposta terapêutica adequada é pouco provável sem alguma toxicidade. É frequente a ocorrência de episódios mucosite, mielossupressão, diarreia e neurotoxicidade entre os doentes submetidos a regime de quimioterapia com 5-FU. Sendo uma molécula de pequenas dimensões, é rapidamente distribuída pelos tecidos corporais e catabolizada pelo fígado, que a inactiva através da redução do anel pirimidínico. O 5-FU é assim rapidamente eliminado pelo corpo, apresentado um período de semi-vida em circulação entre 10 e 20 minutos. Devido a esta rápida eliminação, o efeito terapêutico do 5-FU é condicionado pelo que seria desejável conseguir implementar uma estratégia para prolongar o tempo desta substância na circulação sanguínea. Neste sentido há já várias abordagens registadas, nomeadamente através da síntese de partículas onde o 5-FU é incorporado num transportador proteico ou polimérico. Desta forma podem ainda ser exploradas características como a libertação controlada do princípio activo ou até uma conjugação de substâncias ligadas a um veículo. Tada et al descreveu a síntese de 5-fluorouracil-ácido-acético (FUAc) numa tentativa de melhorar as capacidades antineoplásicas do 5-FU. No entanto não existem no artigo quaisquer referências a testes de citotoxicidade à referida substância. Mais tarde um grupo coreano utilizou um conjugado de FUAc ligado a albumina humana e testou a suas propriedades farmacocinéticas em soluções fisiológicas, no entanto não há referências quanto ao método de síntese nem ao rácio de moléculas de FUAc por moléculas de albumina. Os resultados descritos por este grupo sugerem que a ligação FUAc-albumina é bastante estável uma vez que a libertação de 5-FU do conjugado se limita a cerca de 1% numa solução fisiológica de pH 9. Do ano seguinte, 1990, data uma outra publicação de um grupo coreano referente ao conjugado FUAc-albumina humana, desta vez por Chung et al. Mais uma vez não está descrito o protocolo de síntese, no entanto os resultados obtidos dos testes em coelhos revelaram-se promissores. O conjugado manteve a concentração de 1μg/ml de 5-FU no sangue durante um período de 3 a 24 horas e apenas 5-FU foi libertado das partículas de FUAcalbumina humana, não FUAc. O 5-FU ter-se-á libertado das partículas de FUAc-albumina por um processo ainda desconhecido. Os coelhos receberam uma infusão de suspensão da partícula durante 30 minutos. Foi também descrita a presença de 5-FU no tecido cerebral após a administração de FUAc-albumina humana, ao contrário do que aconteceu com infusões de 5-FU e FUAc. Tendo por base as publicações acima referidas, Koziol et al publicou o protocolo de síntese de um conjugado de FUAc-albumina bovina e ainda a caracterização da mesma partícula e testes de citotoxicidade in vitro. A reacção de síntese da partícula de FUAc foi adaptada de Tada et al. De forma a criar uma ligação covalente entre a molécula proteica, neste caso a albumina bovina, e a de FUAc foi utilizado o método EDC/NHS com algumas adaptações. Este método de cross-linking cria uma ligação covalente entre o grupo carboxilo da molécula de FUAc e os grupos ε-amina livres nas extremidades das cadeias laterais das lisinas. O sucesso da síntese foi confirmado por ionização-dessorção com laser assistida por matriz – tempo de voo (MALDI-TOF), havendo uma média de 12 moléculas de FUAc por albumina. De forma a testar a citotoxicidade do conjugado foram selecionadas duas linhas celulares isoladas de carcinoma mamário, MDA-MB-231 e T-47D. Estas duas linhas celulares diferem entre si na expressão de uma proteína de membrana (mABP – plasmamembrane albumin-binding protein) identificada como influente no uptake de uma partícula, já em uso clínico, de paclitaxel conjugado com albumina [13], sendo que as células da linhas T-47D expressam esta proteína e as MDA-MB-231 não. Foi encontrada uma relação entre a presença desta proteína e a inibição das células uma vez que o efeito exercido pela partícula de UAc-BSA e 5-FU mostrou-se similar. Para o projecto sobre o qual assenta esta tese foram escolhidas três linhas celulares isoladas de carcinoma da mama: MDA-MB-231, T-47D e MCF-7. A terceira linha celular referida expressa a proteína anteriormente referida, mABP, e ainda uma outra também descrita como influente no uptake de nab-paclitaxel, a SPARC (de secreted protein, acidic and rich in cysteine). A síntese do da partícula conjugada foi realizada de acordo com o protocolo descrito por Koziol et al substituindoa albumina bovina por albumina humana (albumina sérica humana – ASH). O sucesso da síntese foi confirmado por MALDI-TOF e foi obtida uma média de 15 moléculas de FUAc por ASH. A conformação da proteína foi analisada por espectroscopia de dicroísmo circular, o que revelou que a estrutura da proteína sofreu apenas alterações pouco consideráveis quando comparável com a albumina antes da reacção de ligação. De forma a testar a capacidade de inibição que a partícula de FUAc-ASH tem sobre as células, estas foram incubadas durante um período máximo de 96 horas com 6 concentrações diferentes da partícula no meio de cultura celular, assim como das outras substâncias puras (FUAc, ASH e 5-FU), de forma a ser possível estabelecer uma comparação. A avaliação do poder de inibição das substâncias sobre as células foi avaliado através do teste de viabilidade celular MTT e posteriormente confirmado através de contagem celular com azul de tripano. Foram incubadas células nas mesmas condições e período de tempo, sem adição de nenhuma das substâncias a testar como controlo. A inibição registada devido ao FUAc-ASH foi menos pronunciada que a obtida pela administração de 5-FU, no entanto foi clara a inibição exercida tanto pela partícula de FUAc-ASH como pela molécula de FUAc. Tal como seria de esperar, foi o 5-FU o composto que causou uma inibição do metabolismo celular mais acentuada. Pelos resultados obtidos não foi possível destacar a importância das proteínas mABP e SPARC no uptake das partículas de FUAc-ASH. No entanto é de salientar que este efeito é sugerido pelos resultados obtidos após 96 horas de incubação, onde as células da linha MCF-7 apresentam uma maior inibição comparativamente às restantes. Esta linha celular apresenta um período de duplicação mais longo do que as restantes duas linhas celulares, portanto é plausível supor que o prolongamento do período de incubação com as substâncias a testar produza resultados mais significativos para uma clarificação da importância das referidas proteínas membranares no uptake do FUAc-ASH. É também de considerar que existem diferenças estruturais entre as albuminas humana e bovina, sendo que a bovina tem vindo a ser descrita na literatura como mais estável. Este facto pode também influenciar a libertação do 5-FU do conjugado, apresentando assim mais uma razão para a necessidade de uma período de incubação mais prolongado. Os resultados obtidos sugerem que o conjugado FUAc-ASH possui características passíveis de uma aplicação clínica, no entanto estes devem ser considerados como preliminares e será necessário uma posterior confirmação do potencial da partícula. A confirmar-se que a partícula de FUAc-ASH actua por meios semelhantes a outros conjugados de albumina já no mercado (Abraxane, por exemplo), esta abordagem poderá representar um avanço significativo no tratamento de cancros susceptíveis à acção do 5-FU.Nowadays, cancer is one of the major death causes worldwide (7.565 million deaths per year according to WHO statistics). Besides the registered developments in cancer treatments, what leads to improved clinical results; the side effects suffered by the patients are still very hard to bear with mainly referring to chemotherapy. In order to reduce these side effects, one of the explored approaches was to link the chemotherapy drug to a carrier suitable to keep the cytotoxic agent in the circulating blood for a longer period and to minify the drug toxicity for the healthy cells. Within this drug carrier approach, human serum albumin was chosen as a suitable carrier and for the active substance the choice fell on one adduct of 5-fluorouracil. 5-Fluorouracil is in clinical usage for many years, mainly for treatment of solid cancers (breast and colon cancer) and, as most of the chemotherapy drugs, its toxicity limits the tolerable administered dosage for treatment. In previous works results showed that the coupling of cytostatic drugs to blood proteins could represent an advantage because it reduces the toxicity and is able to keep the cytostatic action. To synthesize this adduct, named 5-fluorouracil acetic acid (FUAc), an acetic acid side chain was introduce at one of the nitrogen atoms in the » ring. With the attachment of this side chain, 5-FU acquired the ability to bind to the free amine groups of HSA. An average of 15 FUAc molecules were bound to one HSA. The particle conformation was assessed by Circular dichroism (CD) spectroscopy and minimal differences were registered between the spectra of pure HSA and FUAc-HSA, suggesting that the coupling procedure had not induced major structure alterations. Three breast cancer cell lines (MDA-MB-231, T-47D and MCF-7) were chosen for the evaluation of the active agents cytotoxicity. These cell lines were chosen mainly due to their difference in mABP and SPARC proteins expression, reported to have a central role in albumin uptake by the cells. MDA-MB-231 cells do not express these proteins, T-47D is positive for mABP and MCF-7 express both the proteins. Cells were incubated with the four compounds – HSA, FUAc-HSA, FUAc and 5-FUfor periods of 24, 48, 72 and 96 hours. For each compound six different concentrations were taken, from 1 to 500μM. At every 24 hours a MTT assay was performed to assess the inhibition of cell metabolism. The three cell lines tested were inhibited by 5-FU, FUAc and FUAc-HSA but none of them registered inhibition related to HSA. MCF-7 cell line was the one registering a highest metabolism inhibition at 96 hours when incubated with FUAc-HSA. In the previous time points, T-47D cell line registered a higher inhibition when compared with the other cell lines. 5-FU was the substance causing the highest in all cell lines. Regarding to FUAc, MDA-MB- 231 cell line was the one showing the highest inhibition. FUAc-HSA might have advantages upon 5-FU for treating solid cancers although further tests should be performed. The dependence on SPARC for FUAc-HSA uptake by the cells was not clear however metabolism inhibition of MCF-7 cells at 96 hours suggested the relation between this protein and enhanced uptake to be valid