Desenvolvimento de ferramentas químicas para estudar o mecanismo de acção de novas 4-aminoquinazolinas como inibidores da fase hepática da malária

Tese de mestrado, Química Farmacêutica e Terapêutica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2013A malária ou paludismo é uma doença infecciosa provocada por parasitas do género Plasmodium que é transmitida pela picada do mosquito fêmea do género Anopheles. A malária é uma das infecções que mais se propaga por todo o mundo. No entanto, apesar da propagação ter diminuído nos últimos anos, actualmente existem mais pessoas em risco de serem infectadas do que em qualquer outro período temporal. Em 2012, a Organização Mundial de Saúde (OMS) contabilizou 104 países onde a malária é endémica. Globalmente, cerca de 3,3 biliões de pessoas estão em risco de contrair malária, afectando mais de 40% da população mundial, principalmente crianças com menos de 5 anos, mulheres grávidas e respectivos fetos. Apesar da enorme variedade de compostos com actividade antimalárica, a sua grande maioria está descrita como inibidora da fase sanguínea, sendo a fase hepática um estádio da infecção pouco explorado até ao momento. Só recentemente, a investigação começou a dar mais atenção a esta fase da doença, principalmente devido às suas vantagens profiláticas. O presente trabalho focou-se na síntese de novos compostos derivados da 4-aminoquinazolina baseados numa molécula eleita através de um screening fenotípico da fase hepática do ciclo de vida do parasita Plasmodium. De igual forma, este trabalho incidiu no desenvolvimento de novos antimaláricos como inibidores selectivos da fase hepática do parasita (estudo de SAR), explorando então, as características profiláticas das 4-aminoquinazolinas. As 4-aminoquinazolinas 93 e 123 – 129 foram sintetizadas com bons rendimentos e avaliadas quanto às suas actividades antiplasmódicas e citotóxicas em linhas celulares de mamífero. O composto mais activo e selectivo para a fase hepática, desta série, foi o 125 com um IC50 = 5 nM e um índice de selectividade superior a 10,000. Este composto, que contém uma cadeia alquílica lateral com dois carbonos e um átomo de bromo na posição 6 do anel de quinazolina, demonstrou uma actividade in vitro significativamente superior à primaquina (IC50 = 7500 nM). O estudo de SAR revelou que cadeias alquílicas laterais menores diminuem a actividade e substituintes electroatractores e electrodadores nas posições 6 e 7 da função quinazolina potenciam a actividade antiplasmódica. Finalmente, com o intuito de estudar o modo de actuação destes compostos selectivos para a fase hepática, foi proposto explorar novas “ferramentas químicas” para descobrir mais informação sobre o mecanismo de acção destas moléculas. Foram aplicadas metodologias descritas na literatura para a síntese de uma sonda baseada na fluorescência (“turn-on”), onde através de uma reacção biortogonal entre uma tetrazina (acoplada a um fluoróforo - BODIPY) e uma função trans-cicloocteno acoplado à 4-aminoquinazolina em estudo se pode visualizar através de microscopia a zona de actuação do fármaco. Também foi desenvolvida uma metodologia para a síntese de uma sonda de fotoafinidade.Malaria is an infectious disease caused by parasites of genus Plasmodium and transmitted by the bite of female mosquito of the genus Anopheles. Malaria is one of the most spread infections around the world. However, although the rate of infected people has decreased, in recent years, there are now more people at risk of contamination with malaria than at any other time point. In 2012, World Health Organization (WHO) reported 104 countries where malaria is endemic. Globally, about 3.3 billion people are at risk of contracting malaria, affecting more than 40% of the world population, particularly children under 5 years old, pregnant women and their fetuses. Despite the large variety of compounds with antimalarial activity, most of them are act only against erythrocytic stage parasites. The liver stage of infection is still underexploited as a drug target. Only recently, research in antimalarial drug discovery is paying more attention to this stage of the disease, mainly due to its prophylactic benefits. The present work has focused on the synthesis of new 4-aminoquinazolines based on a hit discovered by a high-throughput phenotypic screening for the liver stage of Plasmodium. Similarly, this work focused on the development of new selective inhibitors of the liver stage of the malaria parasite, exploring the prophylactic features of the 4-aminoquinazolines through a structure activity relationship study (SAR). The 4-aminoquinazolines 93 and 123-129 were synthesized in good yields and evaluated for their antiplasmodial and cytotoxic (mammalian cell lines) activities. The most active and selective compound in this series was compound 125 with an IC50 = 5 nM and a selectivity index higher than 10000. This compound contains an alkyl side chain with two carbons and a bromine at 6-position of the quinazoline moiety and was shown to be significantly more potent than primaquine (IC50 = 7500 nM). The SAR study revealed that lower alkyl side chains decrease the activity and electron withdrawing groups and electron donor groups at the 6- and 7-positions of the quinazoline moiety, improve antiplasmodial activity. Finally, in order to study the mechanism of action of these potent compounds, it was proposed to explore new chemical tools to find out more information about the mechanism of action of these molecules. With the purpose of performing in vivo imaging, it were applied methodologies described in the literature to synthesize a “turn-on” probe, exploring the bioorthogonal reaction between a tetrazine (coupled to a BODIPY fluorophore) and a trans-cyclooctene function coupled to the 4-aminoquinazoline. A methodology for the synthesis of a photoaffinity-based probe has also been explored