Estudo do regulador SrrAB do Staphylococcus aureus

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014Staphylococcus aureus é um agente patogénico colonizador de cerca de 30% da população humana, e responsável por causar várias infeções nosocomiais. Com o aparecimento de estirpes resistentes aos antibióticos usados, o estudo deste patogéneo tornou-se urgente para encontrar novos alvos para o combate das infeções. A produção e libertação de espécies reativas de oxigénio e azoto pelas células do sistema imunitário humano causam danos em elementos celulares de S. aureus, como as proteínas com centros de ferro-enxofre. S. aureus possui proteínas capazes de reparar os centros de ferro-enxofre danificados, Repair Iron Center proteins (RIC). Neste trabalho, foi construído um mutante para o gene devido à sua importância para a sobrevivência de S. aureus. Esta mutação (deleção total do gene) foi obtida através da substituição alélica. O sistema de regulação SrrAB está descrito como estando associado à expressão de genes induzidos por NO, como é o caso do gene ric. O desenvolvimento do método para a construção duma estirpe de S. aureus mutada no gene srrA, para estudo deste regulador, foi outro dos objetivos do trabalho. As hemoglobinas truncadas (trHb) são uma família de hemoproteínas e o seu papel funcional não é completamente conhecido, estando proposta uma potencial relação com a resposta de S. aureus ao stress nitrosativo e oxidativo. Para compreender o seu papel em S. aureus, clonou-se o gene codificante desta proteína em três vetores diferentes para se estabelecer quais as condições favoráveis de expressão desta proteína através da realização de vários testes de expressão. Finalmente, para compreender a potencial função protetora desta trHb contra o stress nitrosativo, estudou-se o fenótipo do mutante do seu gene codificante. Em condições semi-aeróbias, foi verificado um atraso na taxa de crescimento da estirpe mutante (ΔtrHb) em relação ao crescimento da estirpe selvagem (JE2).Staphylococcus aureus is a pathogen that colonizes about 30% of the human population and is responsible for several nosocomial infections. With the emergence of strains resistant to antibiotics, the study of this microorganism has become urgent to discover new targets to resist infections. The production and release of nitrogen and oxygen reactive species by human’s immune system cells damages cell components of S. aureus, such as proteins with iron-sulfur centers. S. aureus has proteins capable of repairing the damaged iron-sulfur centers, Repair Iron Center proteins (RIC). In this study, a mutant for the ric gene has been constructed due to its importance for the survival of S. aureus. Allelic replacement was the method used to obtain this mutation, resulting in total deletion of the gene. The regulatory system SrrAB has been described as being associated with gene expression induced by NO, such as the ric gene. The development of a method to generate a strain of S. aureus mutated in the srrA gene, to study this regulatory system, was another objective of this work. Truncated hemoglobins (trHb) are a family of hemoproteins and their functional role is not yet fully understood, but a potential relationship with the response of S. aureus to oxidative and nitrosative stress has been proposed. To understand their role in S. aureus, the gene encoding this protein was cloned in three vectors to establish which conditions favor the expression of this protein by performing several expression assays. To understand the potential protective role of this trHb against nitrosative stress, the phenotype of its mutant strain was tested. Under semi-aerobic conditions was observed a delay in the growth rate of the mutant strain (ΔtrHb) compared to the growth of wild type (JE2)