Phylogenetic insights of Avena genus based on genomic analysis of 45S rDNA molecular organization

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014O género Avena é constituído por 26 espécies com diferentes níveis de ploidia. Neste género existem diplóides com genoma AA ou CC e hibridação entre estas espécies originou os alopoliplóides com genoma AACC e posteriormente AACCDD. Existem ainda autotetraplóides com genoma AABB, uma vez que tanto o genoma B como o D derivaram do genoma A. Englobando espécies com diferentes níveis de ploidia e constituições genómicas diversas, este género é interessante para estudos filogenéticos, mas é igualmente importante economicamente, visto que várias espécies são cultivadas para alimentação. O DNA ribossomal (rDNA), fundamental para a viabilidade celular, é extremamente conservado entre organismos tendo sido extensivamente utilizado para análise filogenética. Em Avena, tanto as sequências de rDNA 5S como os internal transcribed spacers (ITS) do rDNA 45S, foram já sequenciadas e utilizadas para tais estudos. No entanto, devido ao seu tamanho reduzido, estas regiões nem sempre permitem uma distinção clara das relações entre diferentes espécies. Nestes casos, o 5’ external trascribed spacer (5’ ETS), parte do intergenic spacer (IGS) da subunidade 45S, tem vindo a originar resultados mais relevantes. Contudo, em Avena esta região ainda não foi estudada em detalhe. Por outro lado, restruturações de loci Nor (nucleolar organizer regions), as regiões dos cromossomas onde milhares de subunidades 45S de rDNA se encontram repetidas, são comuns em espécies poliplóides e têm sido igualmente descritas no género Avena. Deste modo, este trabalho teve como objectivo avaliar a presença de polimorfismos no IGS das sequências ribossomais 45S entre espécies de aveia, particularmente através da caracterização da sua extremidade 5’ ETS, aferir a utilidade desta região para análise filogenética e inferir a evolução do rDNA 45S no género Avena. Para isso foram analisadas as seguintes espécies: A. strigosa (AA), A. ventricosa (CC), A. eriantha (CC), A. barbata (AABB), A. murphyi (AACC), A. sativa (AACCDD) e A. sterilis (AACCDD). A análise filogenética foi ainda realizada através do estudo de sequências repetitivas dispersas no genoma, como retrotransposões e microssatélites, utilizando as metodologias inter-retrotransposon amplified polymorphism (IRAP) e retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism (REMAP). A amplificação do IGS das referidas espécies com distintas constituições genómicas permitiu verificar que não existem variações entre indivíduos, tendo sido no entanto detectados polimorfismos interespecíficos nesta região, tanto no número como na dimensão dos fragmentos amplificados. Variações deste tipo já tinham sido observadas na espécie hexaplóide Avena sativa, tendo sido proposto que se deviam a alterações no número de repetições de certas sequências presentes tanto no 5’ ETS como no restante IGS. Apesar de ser pouco comum, foi detectada variabilidade na ETS - região que é transcrita e bastante conservada – uma vez que foram observados marcados polimorfismos nestas regiões do genoma nas espécies de Avena analisadas. Surpreendentemente, verificou-se que as espécies diplóides com genoma C contêm 5’ ETS de menores dimensões relativamente às restastes espécies e que um dos haplótipos estudados possui ETS de duas dimensões distintas, enquanto que em todas as restantes espécies foi apenas caracterizado um haplótipo. Adicionalmente, verificou-se que a sequência de menores dimensões amplificada em espécies diploides com o genoma C não está presente nas espécies poliplóides com este genoma (A. murphyi, A. sativa e A. sterilis). A sequenciação desta região revelou a presença de polimorfismos no domínio supostamente reconhecida pela RNA polimerase em A. strigosa, A. sativa e A. sterilis, assim como marcadas diferenças entre genomas na organização e número de motivos repetidos. A análise filogenética das espécies estudadas foi realizada com base na caracterização das IGS do rDNA 45S e ainda utilizando marcadores envolvendo retrotransposões e microssatélites. O dendrograma construído com base nos padrões de bandas obtidos por IRAP e REMAP revelou uma distinção entre as espécies analisadas de acordo com o nível de ploidia e constituição genómica. A informação a obtida com base nas sequências do 5’ ETS mostrou que, apesar da diferença de organização entre o genoma A e C, a distinção entre espécies é semelhante à obtida com os padrões de bandas de IRAP/REMAP. Assim, ficou provado que tanto regiões particularmente lábeis dos genomas, como retrotransposões e microssatélites, como regiões repetitivas codificantes, como as sequências de rDNA, poderão constituir excelentes ferramentas para aprofundar o conhecimento relativamente à biodiversidade no género Avena. As sequências da extremidade 5’ das ETS foram também comparadas com sequências publicadas para membros do mesmo sub-género, género e sub-família. Esta análise revelou que as sequências do genoma C apresentam uma organização mais similar à de outros níveis taxonómicos do que à organização observada nas sequências do genoma A de Avena. Este resultado vem apoiar a ideia de que o genoma C será o genoma ancestral de Avena do qual o genoma A divergiu. Assim, uma vez que a amplificação do 5’ ETS das espécies diplóides com genoma C, revela um polimorfismo não observado nas espécies poliplóides com mesmo genoma, sugerimos que as alterações destas sequências que ocorreram ao longo da evolução do genoma A poderão constituir uma vantagem funcional. Esta hipótese é particularmente interessante considerando as remodelações nos NORs usualmente observadas em espécies poliplóides, como silenciamento, perda e/ou homogeneização. Deste modo, os dados obtidos podem sugerir que em Avena a diferença entre este tipo de sequências pode estar correlacionada com a perda dos NORs do genoma C quando em condição poliploide, o que ainda não tinha sido proposto. Como conclusão, os resultados obtidos neste estudo vieram clarificar a existência de polimorfismos no IGS dos genes ribossomais 45S de distintas espécies de Avena, particularmente nas extremidades 5’ dos ETS dos dois genomas base de género, o que não era esperado dado que esta região é considerada bastante conservada. A análise filogenética destas regiões do genoma permitiu ainda sugerir o modo evolutivo particular de sequências de rDNA, contribuindo para a compreensão das relações filogenéticas das espécies deste género. Para além disso, a sugestão de relações entre a organização distinta das sequências de rDNA e a tendência para a sua eliminação diferencial ao longo da evolução, indica que o estudo do género Avena poderá constituir um modelo extremamente interessante para a caracterização dos mecanismos envolvidos nas reestruturações dos NORs que ocorrem em poliploidia.The genus Avena comprises four distinct genomes organized in diploid, tetraploid and hexaploid species, constituting an interesting model for phylogenetic analysis. The aim of this work was to study genomic diversity of distinct Avena species – A. strigosa, A. ventricosa, A. eriantha, A. barbata, A. murphyi, A. sativa and A. sterilis – through the characterization of 45S rDNA IGS and using retrotransposon and microsatellite targeting markers. The 5’ External transcribed spacer (5’ETS) of the 45S ribosomal DNA has been promising in challenging phylogenetic studies but and has not been studied in detail in Avena genus. This work revealed the existence of length polymorphisms between the two dissimilar A and C genomes that can be ascribed to major differences in the number and organization of repeated motifs. Moreover, C-genome diploid species 5’ ETS organization seems to retain more similarities with other Poaceae species than with Avena A-genome sequences, supporting the hypothesis of C-genome as being the ancestral Avena genome. However, the polyploid species with both genomes retain the A-genome 5’ETS organization and lack the C-genome sequences, suggesting their elimination during polyploid evolution as previously suggested. The phylogenetic analysis obtained with 5’ ETS sequences clustered the species studied according to ploidy and genomic constitution and the analysis of retrotransposons and microsatellites flanking sequences unravel similar results. Thus, our results support the use of the 5’ ETS for phylogenetic inference in Avena species highlighting the evolutive pathways of ribosomal genes in plant species