B cell gene expression in rheumatoid arthritis: effect of immunosuppressive treatment

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune sistémica que se caracteriza pela inflamação crónica das pequenas articulações, particularmente das mãos, bem como articulações maiores, que incluem os joelhos e tornozelos. A prevalência da doença é de cerca de 1% na população mundial adulta e é mais frequente nas mulheres do que nos homens (numa proporção de 3:1). Se não for tratada, a AR origina destruição articular, com erosão óssea e da cartilagem. O diagnóstico da AR é feito de acordo com critérios definidos pelo American College of Rheumatology (ACR)/ European League Against Rheumatism (EULAR), baseados numa avaliação radiológica e atribuição de pontuação relativa ao número de articulações afetadas; serologia de autoanticorpos IgM específicos para o fragmento Fc de imunoglobulinas IgG (fator reumatoide, RF) ou para péptidos cíclicos citrulinados modificados pós-traducionalmente por incorporação de citrulina por ação das peptidil arginina deaminases (anticorpos anti-proteínas citrulinadas, ACPA ou anti-CCP); quantificação de fatores de inflamação (velocidade de sedimentação eritrocitária e proteína-C reativa); e duração da doença. A etiologia da doença é desconhecida, mas sabe-se que a influência do genótipo e do ambiente parecem ser fatores essenciais para o início do processo inflamatório. Em termos de predisposição genética, a AR está associada a mutações no gene HLA-DRB1 que pertence ao complexo maior de histocompatibilidade (MHC) classe II, tendo sido identificada uma curta sequência de aminoácidos comum às proteínas codificadas por todos os alelos de risco - o shared epitope. A AR está também associada a outros genes como o PTPN22 e CTLA-4, entre outros. Em relação aos fatores ambientais, a maior associação descrita está relacionada com o tabagismo, sendo que o risco parece ser maior em indivíduos portadores do shared epitope. O efeito da exposição a alguns agentes infeciosos é controverso, mas alguns estudos indicam que poderá levar à formação de complexos imunes, implicados na AR. Também algumas alterações hormonais na mulher, como a gravidez, amamentação e contraceção oral, podem influenciar o desenvolvimento da doença. No processo inflamatório da AR ocorre uma resposta celular e humoral que contribui para o desenvolvimento da sinovite, ou seja, a inflamação da membrana sinovial, que é a membrana que reveste a articulação. A hiperplasia da sinóvia resulta de uma migração e excessiva infiltração de linfócitos T e B, plasmócitos, células dendríticas, macrófagos, neutrófilos e mastócitos, assim como da ativação dos FLS – fibroblast‐like synoviocytes – que produzem citocinas pro-inflamatórias, provocando a ativação de outras células. A ativação de macrófagos através dos recetores Fc gama por complexos imunes que se formam a partir de autoanticorpos (RF e ACPA), produzidos por células B autoreactivas, juntamente com estímulos derivados de células T activadas, conduz à libertação de citocinas como a IL-1, IL-6, IL-15, INF-γ e TNF. Algumas destas citocinas ativam células sinoviais residentes a produzir enzimas proteolíticas, como a colagenase e metaloproteinases da matriz que medeiam a destruição da cartilagem. A destruição óssea também ocorre devido ao aumento da atividade dos osteoclastos, ativados através das ligações RANK/ RANK-L. Nos últimos anos, os linfócitos B têm sido alvo de investigação, particularmente após a eficácia clínica observada com a terapia de depleção de células B com rituximab (anticorpo monoclonal anti-CD20). De facto, os linfócitos B podem contribuir de diversas formas para o desenvolvimento da AR, tais como: 1) produção de autoanticorpos como o RF e os ACPA, que formam complexos imunes que se depositam nas articulações e causam inflamação; 2) apresentação de antigénios e ativação de linfócitos T; 3) secreção de citocinas; 4) ativação de osteoclastos que levam à erosão óssea; 5) imunoregulação por células B reguladoras, que produzem citocinas anti-inflamatórias (IL-10 e TGF-β1) que inibem células T ativadas e restauram o balano TH1/TH2. Apesar da AR não ter cura, é fundamental estabelecer um diagnóstico precoce para que se possa proceder ao tratamento e reduzir os sintomas no doente e a progressão da doença o mais rapidamente possivel. O tratamento da AR faz-se com anti-inflamatórios não esteroides (AINES), sendo que estes apenas diminuem a atividade inflamatória; corticoesteróides; DMARDs - agentes antirreumáticos modificadores da doença – sintéticos, onde se encontram o metotrexato (MTX), sulfassalazina (SSZ), hidroxicloroquina (HCQ) e a leflunomida, ou biológicos, que são geralmente anticorpos monoclonais que bloqueiam determinadas citocinas ou recetores celulares. Entre os DMARDs biológicos aprovados para tratamento da AR estão, por exemplo, os anti-TNF (etanercept, infliximab, golimumab, adalimumab e certolizumab), o tocilizumab – TCZ (anti-receptor da IL-6) e o rituximab (anti-CD20). Os DMARDs são conhecidos por melhorarem a capacidade funcional global, reduzirem os danos radiológicos e diminuirem os valores clínicos e laboratoriais associados à inflamação. Nem sempre os doentes respondem favoravelmente à terapêutica, podendo apresentar efeitos secundários graves devido ao efeito imunosupressor e/ ou mantendo níveis de atividade de doença elevados, o que obriga muitas vezes a alterações no tratamento, procedendo-se a mudanca entre anti-TNFs, ou mesmo para outros biológicos, como o TCZ e o rituximab. O principal objetivo deste trabalho consistiu na análise de um grupo de genes relacionados com a ativação e sobrevivência dos linfócitos B (BAFF-R, TACI, BCMA), mudança de classe e hipermutação somática (AID), diferenciação de plasmócitos (BLIMP-1), quimiotaxia (CXCR5), apoptose (BCL- 2), inibição (CD32), inflamação (B2M) e ativação de células B através de Toll-like receptors (TLR7, TLR9, TLR10) em doentes não tratados com AR inicial (ERA) (≤1 ano de duração da doença) e na comparação da expressão dos mesmos genes com doentes com AR estabelecida após tratamento com MTX, MTX pré-biológico (MTX pre-bio, isto é antes do início de terapêutica com agentes biológicos), anti-TNF e TCZ. Para tal, amostras de sangue periférico foram colhidas a doentes ERA (n=13) e AR estabelecidas após tratamento com MTX (n=15) e MTX pre-bio (n=25). No grupo de doentes MTX pre-bio, foi efetuada uma segunda colheita de sangue a um grupo de doentes com AR após 8 meses de tratamento com anti-TNF (n=7) e a outro grupo após 6 meses de tratamento com TCZ (n=9). Amostras de sangue de controlos saudáveis (n=15) com a mesma proporção de idades e género foram também colhidas e processadas para comparação de resultados. Procedeu-se ao isolamento das células mononucleares do sangue periférico (linfócitos B e T, monócitos e granulócitos) e, posteriormente, separam-se os linfócitos B. De seguida, a partir dos linfócitos B isolados com purezas acima dos 90%, extraiu-se o RNA, sintetizou-se o DNA complementar (cDNA) e fizeram-se ensaios de PCR em tempo real para estudar a expressão génica do grupo de genes acima mencionados. Os resultados da expressão génica revelaram um aumento dos níveis de mRNA do BAFF-R no grupo de doentes com AR estabelecida tratados com MTX (p=0.0212) e anti-TNF (p=0.0025) relativamente aos controlos. Além disso, também se observou um aumento da expressão do BAFF-R no grupo de doentes tratados com anti-TNF quando comparado com os doentes ERA (p=0.0006). Por outro lado, nao foram observadas diferenças significativas na expressão génica de TACI e BCMA em todos os grupos analisados. A análise da expressão génica dos Toll-like receptors revelou diferenças significativas nos grupos de doentes com AR estabelecida em comparação com os controlos. De facto, verificou-se um aumento da expressão de TLR7 e TLR10 no grupo de doentes com AR estabelecida tratados com anti-TNF em relação aos controlos (p=0.0385 e p=0.0097, respetivamente) e, além disso, foi também observado um aumento da expressão do gene TLR10 nos doentes tratados com anti-TNF quando comparados com os doentes ERA (p=0.0801). Adicionalmente, foi observado um aumento da expressão do gene TLR9 nos linfócitos B do grupo de doentes com AR estabelecida após tratamento com MTX relativamente aos controlos (p=0.0043). Verificou-se também uma sobreexpressão do gene B2M em todos os grupos de AR estabelecida quando comparados com os controlos: MTX (p=0.0099), MTX pre-bio (p=0.0116), anti-TNF (p=0.0025) e TCZ (p=0.0112), embora não tenham sido detetadas diferenças significativas nos doentes ERA. Observou-se ainda que os níveis de expressão do gene BCL-2 estavam significativamente elevados em doentes com AR estabelecida após tratamento com MTX (p<0.0001), MTX pre-bio (p<0.0001), anti-TNF (p=0.0014) e TCZ (p=0.0042) não só em comparação com os controlos, mas também com os doentes ERA (p<0.0001). Além disso, verificou-se um aumento significativo nos níveis de expressão génica de CD32 nos doentes com AR estabelecida após tratamento com anti-TNF quando comparados com os controlos (p=0.0043) e com os doentes ERA (p=0.0015). Observou-se ainda um ligeiro aumento da expressão génica de CD32 em doentes com AR estabelecida após tratamento com MTX pre-bio relativamente aos controlos (p=0.0487). Contudo, foi observado um aumento significativo da expressão de CD32 neste grupo quando comparado com os doentes ERA (p=0.0015). Adicionalmente, não foram observadas diferenças significativas na expressão génica de CXCR5, AID e BLIMP-1 em todos os grupos analisados. Por fim, quando se procedeu à análise da expressão génica antes e após o tratamento com anti-TNF e TCZ, não foram observadas quaisquer diferenças significativas para todos os genes estudados. Em relação aos dados clínicos dos doentes, verificou-se ainda que o tratamento com TCZ comparativamente com as outras terapêuticas estudadas, parece ser o mais eficaz a reduzir significativamente os valores séricos da proteina-C reativa, a velocidade de sedimentação e a actividade geral da doença indicada pelo DAS28. De salientar, no entanto, que nao foi observada nenhuma correlação significativa entre a idade, os valores da proteína-C reactiva, a velocidade de sedimentação, o DAS28 e o numero de articulações dolorosas e tumefactas com os resultados obtidos da expressão génica para todos os grupos estudados, independentemente do tratamento administrado aos doentes. Com a realização deste estudo foi possível concluir que em doentes com AR estabelecida existem alterações na expressão de genes associados à ativação dos linfócitos B, quer através do recetor do BAFF (BAFF-R), quer através de TLRs (TLR7, TLR9, TLR10); e/ ou à inibição de linfocitos B (CD32), assim como perturbações na expressão de genes associados à inflamação (B2M) e apoptose (BCL-2). Nos doentes com AR estabelecida, o tratamento com anti-TNF e TCZ parece influenciar a expressão destes genes em comparação com os indivíduos saudáveis, embora nao sejam detectadas diferenças significativas na expressão génica em relação à fase anterior ao início do tratamento. Além disso, a expressão génica em doentes não tratados com AR inicial com menos de 1 ano de duração da doença parece ser semelhante a dos indivíduos saudáveis. Estes resultados sugerem que a expressão génica de linfócitos B em doentes com AR sofre alterações em diferentes fases de desenvolvimento da doença, podendo ser influenciada pelas opções terapêuticas.Rheumatoid arthritis (RA) is a systemic autoimmune disease that mainly affects the joints. The clinical success of B cell depletion therapy with rituximab in RA has reinforced the role of B cells in RA pathogenesis. Indeed, recent studies have shown that very early RA patients (with less than 6 weeks of disease duration) have disturbances in circulating memory B cells and increased levels of cytokines directly related with B cell activation and survival, which supports an active role of B cells in RA development since early disease onset. The main goal of the present study was to analyze the expression of a group of genes directly related with B cell activation, maturation and survival in untreated early RA (ERA) (< 1 year of disease duration) and established RA patients after treatment with methotrexate (MTX), MTX pre-biologic (MTX pre-bio), TNF inhibitors and tocilizumab (TCZ) in order to compare the effects of the therapeutic options on B cell gene expression. For that, blood samples were collected from patients and age and sex-matched healthy donors. B cells were isolated, RNA extracted, cDNA synthesized and gene expression analysis performed by real time PCR. We found that ERA patients have similar B cell gene expression levels when compared to healthy controls. However, increased gene expression was observed in BAFF receptor (BAFF-R), Toll-like receptors (TLR7, TLR9, TLR10), inhibition marker (CD32) and in genes associated with either active inflammation (B2M) or apoptosis (BCL-2) signaling pathways in established RA patients when compared to controls. No significant differences were observed in TACI, BCMA, CXCR5, AID and BLIMP-1 gene expression in all groups analyzed. Furthermore, the analysis of B cell gene expression levels in established RA patients after treatment with TNF inhibitors and TCZ in comparison with baseline values did not reveal significant differences. Overall, these results suggest that the expression of genes related with B cell activation and survival are increased in later stages of RA development, which might be influenced by treatment options when compared to healthy individuals. Moreover, B cell gene expression in early RA patients does not seem to significantly change during the first year of RA development when compared to controls