Avaliação da citotoxidade e genotoxidade da glicidamida em células mamárias humanas

Tese de mestrado, Controlo de Qualidade e Toxicologia dos Alimentos, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2010Nos últimos anos, têm sido observadas quantidades relevantes de acrilamida (AA) num grande número de alimentos ricos em amido após processamento térmico (ex. batatas fritas). Estes dados recentes sugerem que o consumo oral de AA é um factor de risco adicional para o cancro. Neste contexto, a AA tem sido apontada como um potencial agente cancerígeno para o tecido mamário, uma vez que em estudos efectuados com roedores foram observados tumores benignos e malignos da glândula mamária. Um número considerável de evidências apontam para que o metabolito glicidamida (GA), um epóxido gerado pela biotransformação presumivelmente via CYP2E1, desempenhe um papel central na cancerigénese associada à exposição a AA. O trabalho aqui descrito mostra os efeitos citotóxicos e genotóxicos induzidos pela GA em células humanas MCF10A. Estas células mimetizam as células mamárias ductais e têm sido amplamente adoptadas como modelo celular de referência de células de mama não tumorais. As metodologias utilizadas neste trabalho incluem a avaliação da viabilidade celular utilizando o ensaio de redução do MTT, a geração de espécies reactivas de oxigénio (ROS), utilizando o ensaio da dihidrorodamina 123 e a avaliação de genotoxicidade utilizando o teste do micronúcleo em células MCF10A com a citocinese bloqueada. A GA induziu um decréscimo dependente da concentração da viabilidade celular em células MCF10A. A pré-incubação com butionina sulfoximina (BSO), um inibidor da síntese de glutationo reduzido (GSH), provocou um marcado decréscimo na viabilidade das células tratadas com 1,0 mM de GA (P<0,01), enquanto a incubação concomitante de GSH com GA (3,0 mM) apresentou um ligeiro aumento da viabilidade celular. A coincubação com superóxido dismutase peguilada (SOD-PEG), catalase peguilada (CATPEG), ou um antioxidante catalítico sintético (SOD mimético) não mostrou alterar a viabilidade celular das células MCF10A expostas à GA. Adicionalmente, o tratamento com diferentes concentrações de GA não aumentou os níveis de ROS nas células MCF10A. A exposição de células MCF10A à GA levou a um aumento na frequência de células binucleadas micronucleadas (%MNBN), especialmente para a concentração 1,0 mM (~2 vezes, P <0,01). Para a maior concentração de GA testada (2,0 mM) foi observada uma redução forte da % de células binucleadas, mostrando uma interferência importante ao nível da divisão celular. Em resumo, estes resultados mostram que a GA é citotóxica e genotóxica para as células MCF10A, sendo o GSH importante para a redução da toxicidade da GA. Além disso, a geração de ROS não parece ser um mecanismo relevante para os efeitos celulares induzidos pela GA em células MCF10A.In the last years, significant amounts of acrylamide (AA) have been confirmed in a wide number of starchy cooked foods (e.g. fried chips). These new data suggest that the oral consumption of AA is an additional risk factor for cancer. In this context, AA has been pointed out as a suspected human breast carcinogen since in rodent studies both benign and malignant mammary gland tumors have been observed. A considerable number of findings strongly suggest that the reactive metabolite glycidamide (GA), an epoxide generated presumably by CYP2E1 biotransformation, plays a central role in AA carcinogenesis. The work reported here addresses GA-induced cytotoxic and genotoxic effects in human MCF10A cells. These cells mimic the mammary ductal cells and have been widely adopted as the reference cell model of non-malignant breast cells. The methodologies used herein included the evaluation of cell viability using the MTT reduction assay, the generation of reactive oxygen species (ROS) using the dihydrorhodamine 123 assay and the assessment of genotoxicity using the cytokinesisblocked micronucleus assay. GA induced dose-dependent decrease in MCF10A cell viability. Pre-incubation with buthionine sulfoximine (BSO), a reduced glutathione (GSH) synthesis inhibitor, markedly decreased cell viability of 1 mM GA-treated cells (P<0.01), whereas the concomitant incubation of GSH with GA (3.0 mM) mildly increased cell viability. The incubation with either pegylated superoxide dismutase (SOD-PEG), or pegylated catalase (CAT-PEG) or a synthetic catalytic antioxidant (SOD mimetic) did not modify cell viability of GA exposed cells. Additionally, treatment with different GA concentrations did not increase the levels of ROS in MCF10A cells. The exposure of MCF10A cells to GA led to an increase in the frequency of micronucleated binucleated (%MNBN) cells, especially for 1.0 mM concentration (~2 fold, P