Estudio funcional de las Beta Glucosidasas del hongo Talaromyces amestolkiae: aplicaciones biotecnológicas y diseño racional de catalizadores

283 p.-67 fig.-27 tab.-anexo.[EN]Plant biomass represents an important renewable source of raw materials since most of the carbon fixed by photosynthesis is contained in the cell walls. These cell walls are mainly composed of cellulose, hemicellulose and lignin. The degradation of the latter is the key to have access to polysaccharides. It is also essential to find specific enzymes for the complete hydrolysis of cellulose and hemicellulose, and then be able to use all their components for different biotechnological applications. Regarding cellulose, this polysaccharide is the major constituent of the plant cell wall (30-50%, depending on the plant type). By its conversion into glucose monomers it could be transformed into biofuels, or other high added value products. There are many organisms able to successfully degrade cellulose, secreting enzymes that can be used for different biotechnological applications. Currently, filamentous fungi are the main source of this type of enzymes for commercial use, which are characterized by their high productivity and high catalytic efficiency with respect to the ones secreted by other microorganisms. There are three types of cellulases, which act in a coordinated way to degrade cellulose to glucose: endoglucanases, cellobiohydrolases and β-glucosidases. So far, the greatest efforts have been focused on discovering new β-glucosidases, which represent the key step in cellulose degradation. The aim of the work was to deepen in the knowledge of the β-glucosidases produced by the fungus T. amestolkiae, robust enzymes that have an essential role in the transformation of cellulose, and are capable of acting both in hydrolysis reactions, or in the synthesis of glycosides with potential interest in different technological sectors. To achieve these objectives, the work plan was: 1- Analysis of the genome and secretome of T. amestolkiae, showing special interest in the β-glucosidases produced by this fungus.2- Heterologous expression of the main β-glucosidases of T. amestolkiae in P. pastoris, its purification, characterization and comparison with the native enzymes of the fungus. 3- Study of the saccharification of lignocellulosic residues using commercial enzymatic cocktails supplemented with T. amestolkiae β-glucosidases. 4- Synthesis of glycosides of interest with transglycosylation reactions catalyzed by T. amestolkiae β-glucosidases. 5- Obtaining variants of these enzymes to improve yields in the synthesis of glycosides of interest. Study of T. amestolkiae genome and proteome Genomic and proteomic analysis are potent tools for metabolic characterization of microorganisms. T. amestolkiae was described as an excellent cellulase-producer, secreting high levels of β-1,4-endoglucanase, cellobiohydrolase and β-glucosidase activities. Its genome contains several genes encoding β-glucosidases and the fungus secretes high levels of this activity, regardless of the carbon source available. Two main different β-glucosidases have been identified from proteomic shotgun analysis. One of them is produced under different carbon sources, while the other is induced in cellulosic substrates and is a good supplement to Celluclast in saccharification of pretreated wheat straw. BGL-2 characterization: the first β-1,4-glucosidase described with a cellulose binding domain The discovery of novel, highly-efficient β-glucosidases remains as one of the major bottlenecks for cellulose degradation. BGL-2 is the major β-glucosidase secreted by this fungus in the presence of cellulosic inductors. This enzyme possesses a Cellulose Binding Domain (CBD), an unusual feature among this type of proteins. Besides, when growing on cellulose, the fungus produced two different bgl-2 mRNAs that were retrotranscribed into cDNA, cloned and expressed in Pichia pastoris. A complete recombinant protein (BGL-2*) and its truncated form, lacking CBD (BGL-2T*) were produced, being both completely functional proteins. All tested BGL-2 forms were highly efficient using cellobiose and other short oligosaccharides as substrates. As one of its potential biotechnological applications, the recombinant T. amestolkiae enzymes were studied in saccharification of brewers’ spent grain, reaching a yield comparable to that of commercial β-glucosidase cocktails. Characterization of BGL-3, a versatile β-glucosidase BGL-3 has been purified, characterized, and heterologously produced. The synthesis of this -glucosidase (BGL-3) was not induced by cellulose, and the presence of a specific carbon source is not required for its secretion, since its synthesis is triggered by carbon starvation stimuli. The enzyme showed high thermal stability, and very high efficiency on pNPG, cellobiose and other cellooligosaccharides. Surprisingly, it also showed remarkable ability to hydrolyze laminarin, a β-1,3-glucan with β-1,6 branches present in algae. The enzyme’s efficiency was examined in wheat straw saccharification, in which BGL-3 worked better supplementing Celluclast 1.5L than the commercial cellulase cocktail N-50010. Besides, BGL-3 hydrolyzed laminarin more efficiently than a commercial laminarinase.Characterization of BGL-1, a glucotolerant β-glucosidase One of the most desired features for these enzymes is glucose tolerance, which allows them to act optimally under elevated glucose concentrations. A glucotolerant β-glucosidase, named BGL-1, has been heterologously expressed in P. pastoris, purified, and characterized. The production of the enzyme in the yeast was very high, reaching 75 U/mL, and it was purified in just one step with a yield of 80%. The most outstanding feature of BGL-1 was its glucotolerance, with a Ki of 3.87 mM, one of the highest reported up to date. Interestingly, when examining the substrate specificity of BGL-1, it was more active over sophorose, the -1,2 disaccharide of glucose, than over cellobiose. Synthesis of glycosides using the β-glucosidases of T. amestolkiae Transglycosylation represents one of the most promising approaches for obtaining novel glycosides. Transglycosylation experiments were carried out using the recombinant BGL-2 and BGL-3 β-glucosidases from the fungus T. amestolkiae. After a first screening with a wide variety of potential transglycosylation acceptors, mono-glucosylated derivatives of hydroxytyrosol, vanillin alcohol, 4-hydroxybenzyl alcohol, and hydroquinone were detected. Hydroxytyrosol and vanillyl alcohol were selected as the best options for transglycosylation. The evaluation of the biological effect of these glucosides using models of breast cancer cells, showed an enhancement in the anti-proliferative capacity of the vanillin derivative, and an improved safety profile of both glucosides. Besides, the transglycosylation profile of BGL-1 was also examined, and, for expanding its synthesis capacities, it was converted into a glycosynthase. The mutant enzyme, named BGL-1-E521G, was able to use α-D-glucosyl-fluoride as donor in glycosylation reactions, and synthesized in a regioselective manner glycosylated derivatives of different pNP- sugars, but also of some phenolic compounds of industrial interest as epigallocatechin gallate. The work carried out in this Doctoral Thesis has disclosed that the genome of the fungus T. amestolkiae contains several genes that encode β-glucosidases and secretes high levels of this activity, regardless of the availability of the carbon source. Two main different β-glucosidases have been identified from proteomic analysis. One of them was produced under several carbon sources, while the other was induced only in cellulosic substrates. In addition, three new β-glucosidases, enzymes that can be applied in saccharification processes of lignocellulosic residues, and in obtaining other value-added products, have been isolated and characterized. BGL-2 and BGL-3 were successfully used in the saccharification of pre-treated wheat straw and brewers spent grain. BGL-1 showed an enormous glucotolerance, which can position it to be used in industrial processes that require high glucose concentrations. In addition, all enzymes showed transglycosylation capacity. BGL-2 had a wide range of potential acceptors, altogether with high yields in the synthesis, and is regioselective. The use of these characteristics allowed the enzymatic production of two glycosides, from hydroxytyrosol and vanillin, with improved bioactive properties. To raise the transglycosylation capacity of these enzymes, BGL-1 was converted into a glycosynthase, which was able to transfer glucose molecules to different compounds of interest.[ES]La biomasa vegetal representa una importante fuente renovable de materia prima, ya que sus paredes celulares constituyen la mayor parte del carbono fijado por fotosíntesis. Estas paredes celulares están compuestas principalmente por celulosa, hemicelulosa y lignina. La degradación de esta última es clave para utilizar los polisacáridos de la pared celular vegetal, pero también es clave encontrar complejos enzimáticos eficaces para la hidrólisis completa de la celulosa y hemicelulosa, y así poder utilizar todos los carbohidratos que éstas contienen en diferentes aplicaciones biotecnológicas. En lo referente a la celulosa, es el componente mayoritario de la pared celular vegetal (30-50%, dependiendo del tipo de planta). Industrialmente, interesa tanto su sacarificación en monómeros de glucosa, con vistas a la obtención de biocombustibles, como su conversión en productos de alto valor añadido. Existen en la naturaleza numerosos organismos capaces de aprovechar con éxito la celulosa, secretando enzimas que pueden ser usadas en diferentes aplicaciones biotecnológicas. Actualmente, los hongos filamentosos son la principal fuente de estas enzimas para uso comercial, y suelen caracterizarse por su alta productividad y eficacia catalítica, con respecto a las de otros microorganismos. Existen tres tipos de celulasas, que actúan de forma coordinada para degradar la celulosa hasta moléculas de glucosa: endoglucanasas, celobiohidrolasas y -glucosidasas. Aunque todas son necesarias en los cócteles enzimáticos, los mayores esfuerzos en los últimos años se han centrado en descubrir nuevas -glucosidasas, ya que representan el paso clave para la sacarificación de la celulosa y la mayor parte de los cócteles enzimáticos comerciales requieren ser suplementados con -glucosidasas robustas, especialmente para la producción de bioetanol de segunda generación. El objetivo del trabajo fue profundizar en el conocimiento de las glucosidasas producidas por el hongo T. amestolkiae, enzimas robustas que poseen un papel esencial en la transformación de la celulosa, y son capaces de actuar tanto en reacciones de hidrólisis, como en la síntesis de glucósidos con potencial interés en diferentes sectores tecnológicos. Para conseguir estos objetivos, el plan de trabajo fue: 1- Análisis del genoma de T. amestolkiae y de su secretoma, con especial interés en las -glucosidasas producidas por este hongo. 2- Expresión heteróloga de las principales glucosidasas de T. amestolkiae en P. pastoris, su purificación y caracterización, y su comparación con las enzimas nativas del hongo.3- Estudio de la sacarificación de residuos lignocelulósicos utilizando cócteles comerciales suplementados con glucosidasas de T. amestolkiae. 4- Obtención de glucósidos de interés mediante reacciones de transglicosilación catalizadas por las glucosidasas de T. amestolkiae. 5- Obtención de variantes de estas enzimas para mejorar los rendimientos en la síntesis de glicósidos de interés. Estudio del genoma y proteoma del hongo T. amestolkiae Los análisis genómicos y proteómicos son herramientas potentes para la caracterización metabólica de microorganismos. El hongo Talaromyces amestolkiae demostró ser un excelente productor de celulasas, secretando altos niveles de β-glucosidasas, β-1,4-endoglucanasas, y celobiohidrolasas. La secuenciación y el análisis del genoma de este hongo revelaron la existencia de múltiples genes que codifican β-glucosidasas. Además, en los análisis de los secretomas del hongo, se identificaron tres β-glucosidasas, de las cuales dos fueron mayoritarias. La primera se produjo en cultivos inducidos en presencia de celulosa o lignocelulosa, mientras la otra se produjo en todos los medios estudiados, cuando el carbono se agotaba en el cultivo. Caracterización de BGL-2, la primera β-1,4-glucosidasa con un dominio de unión a celulosa El descubrimiento de nuevas β-glucosidasas altamente eficientes sigue siendo uno de los principales cuellos de botella para la degradación de la celulosa. La BGL-2 es la principal β-glucosidasa secretada por este hongo T. amestolkiae, en presencia de inductores celulósicos. Es una glicosil hidrolasa de la familia GH3 y posee un CBD (dominio de unión a celulosa), una característica inusual en este tipo de proteínas. Cuando se analizó la expresión de esta enzima, se vió que el hongo produjo dos formas de RNAm para el gen bgl-2. Ambas formas se retrotranscribieron a cDNA y se clonaron en Pichia pastoris, obteniéndose una proteína con el CBD (BGL-2*) y su forma truncada, que carece de CBD (BGL-2T*). Las dos versiones de la enzima BGL-2 fueron perfectamente funcionales, y altamente eficientes utilizando celobiosa y otros oligosacáridos. La sacarificación de bagazo de cerveza con un coctel comercial basal y estas enzimas, frente a -glucosidasas comerciales, puso de manifiesto que con las enzimas de T. amestolkiae se producen altos rendimientos en la sacarificación de este material lignocelulósico, comparable a los obtenidos al suplementar los cócteles con β-glucosidasas comerciales.Caracterización de BGL-3, una β-glucosidasa versátil e inducible cuando se agota la fuente de carbono La β-glucosidasa BGL-3, fue purificada, caracterizada y expresada heterólogamente. La síntesis de esta enzima en el hongo T. amestolkiae no requirió la presencia de una fuente de carbono específica debido a que se produce bajo estímulos de agotamiento de carbono. La enzima mostró una alta estabilidad térmica y una muy alta eficiencia sobre sustratos como pNPG, celobiosa y otros celooligosacáridos. Sorprendentemente, también mostró una capacidad notable para hidrolizar laminarina, un β-1,3-glucano presente en las algas. La eficacia de la enzima se examinó en procesos de sacarificación de paja de trigo, en los que BGL-3 funcionó mejor que un cóctel comercial de glucosidasas. Además, fue capaz de hidrolizar laminarina más eficientemente que una laminarinasa comercial. Caracterización de BGL-1, una β-glucosidasa glucotolerante Una de las características más deseadas para estas enzimas es la tolerancia a la glucosa, que les permite actuar de manera óptima en procesos que requieran concentraciones altas de este monosacárido. La β- glucosidasa BGL-1 del hongo T. amestolkiae fue una enzima muy minoritaria en todos los culivos estudiados. Esta enzima, que pertenece a la familia GH1, fue expresada heterólogamente en P. pastoris, purificada y caracterizada. La producción de BGL-1 en la levadura fue muy alta, alcanzando 75 U/mL, y se purificó en un solo paso cromatográfico, con un rendimiento del 80%. La característica más sobresaliente de BGL-1 fue su glucotolerancia, presentando un Ki de 3.87 mM, uno de los más altos detectados hasta la fecha. Aunque esta enzima resultó no ser tan eficiente como las BGL-2 y BGL-3 hidrolizando celobiosa y celooligosacarido, presentó una alta eficacia catalítica sobre soforosa, el dímero de glucosa con enlaces β-1,2. Síntesis de glicósidos de interés usando las β-glucosidasa de T. amestolkiae La transglicosilación enzimática es una de las técnicas más prometedoras para obtener nuevos glicoconjugados. Diferentes experimentos de transglicosilación se llevaron a cabo utilizando las β-glucosidasas BGL-2 y BGL-3 del hongo T. amestolkiae. Después de un primer análisis, en el que se puso de manifiesto que podían utilizar una amplia variedad de aceptores potenciales para llevar a cabo su transglicosilación, se identificaron derivados mono-glucosilados de hidroxitirosol, alcohol vainillínico, alcohol 4-hidroxibencílico e hidroquinona. El hidroxitirosol y el alcohol vainillínico se seleccionaron para continuar estos estudios por sus posibles aplicaciones. Tras obtener sus respectivos glucósidos y purificarlos, se evaluó su efecto biológico usando modelos de células de cáncer de mama. Ambos compuestos mostraron un incremento de la capacidad antiproliferativa, respecto a los compuestos no glicosilados. Mediante ingeniería de proteínas (diseño racional), se convirtió la BGL-1 en una glicosintasa. BGL-1-E521G, que fue capaz de utilizar glucosa fluorada como donador en reacciones de transglicosilación, en las que se sintetizaron de manera regioselectiva derivados glicosilados de diferentes p-nitrofenoles, así como de algunos compuestos fenólicos de gran interés como el galato de epigalocatequina, un antioxidante presente en el té verde con interesantes propiedades para la salud. El trabajo realizado en la presente tesis doctoral demuestra que el genoma del hongo T. amestolkiae contiene varios genes que codifican β-glucosidasas y secreta altos niveles de esta actividad, independientemente de la disponibilidad de la fuente de carbono. Se han identificado dos principales β-glucosidasas diferentes a partir del análisis proteómico. Una de ellas se produjo en todas las condiciones estudiadas, mientras que la otra se indujo únicamente en sustratos celulósicos. Se han purificado y caracterizado tres nuevas β-glucosidasas que pueden ser aplicadas en procesos de sacarificación de residuos lignocelulósicos, y en la obtención de otros productos de valor añadido. BGL-2 y BGL-3 se utilizaron exitosamente en la sacarificación de la celulosa de bagazo de cerveza y paja de trigo pretratada. BGL-1 mostró una enorme glucotolerancia, lo cual puede resultar ventajoso en su utilización en procesos donde se produzcan elevadas concentraciones de glucosa. Además, todas las enzimas fueron capaces de catalizar reacciones de transglicosilación. BGL-2 puede utilizar un amplio rango de posibles moléculas aceptoras de transglicosilación, mostrando altos rendimientos y regioselectividad. El aprovechamiento de estas características permitió la síntesis enzimática de dos glucósidos, de hidroxitirosol y vainillina, con propiedades bioactivas. Para profundizar en la capacidad de transglicosilación de estas enzimas, BGL-1 se transformó en su variante glicosintasa mediante diseño racional, siendo capaz de transferir moléculas de glucosa a diferentes compuestos de interés.Proyectos BIO2015-68387-R del MINECO y RETO-PROSOT S2013/MAE-2972 de la Comunidad de Madrid. Beca predoctoral concedida por la Fundación Tatiana Pérez de Guzmán el Bueno, en el área de medioambiente.Peer reviewe