Aspectos estructurales de peroxidasas de tipo DYP de Auricularia auricularia-judae y de Pleurotus ostreatus

137 p.-53 fig.-13 tab.[EN]Heme peroxidases catalyse the hydrogen peroxide–dependent oxidation of a wide variety of substrates. Dye–decolorizing peroxidases are bacterial, archaeal, protist and fungal heme proteins with a high diversity of amino acid sequences. This family has a remarkable stability at extreme temperature, pressure and pH values. A distinct characteristic of these enzymes is their ability to oxidize a broad range of compounds, including poorly biodegradable materials such as lignin. DyPs exhibit a high decolorizing activity by oxidizing recalcitrant and dispersive dyes such as anthraquinone and azo dyes. Its high stability and its catalytic activity against poorly biodegradable compounds, arouses a great biotechnological interest in different fields such as bioremediation, biofuels production, bioconversion of raw materials or organic synthesis. In collaboration with Biotechnology for the Lignocellulosic Biomass group at Biological Reasearch Center (CSIC), in this thesis we have solved the structures of two fungal dye–decolorizing peroxidases from white–rot basidiomycetes: DyP1 from Auricularia auricula–judae and DyP4 from Pleurotus ostreatus. Previous crystallographic and kinetic studies of DyP1 from A. auricula–judae have reported the structures of wild type enzyme and several variants. This work reveals that the oxidation of bulky substrates is produced by surface exposed aromatic residues, tyrosine and tryptophan, and mediated by a long–range electron transfer. The purpose of this work is to increase the accessibility of the small substrates to heme pocket, by engineering the heme access channel. In order to obtain a better access to this heme cofactor, mutants L357G and F359G were designed. All of wild types and mutant enzymes were cloned into the pET23a vector and expressed in Escherichia coli. The "In vitro" refolding of these proteins is required before purification by ion exchange chromatography. Afterwards kinetic and computational analysis were performed, and visually high–quality crystals were obtained in the crystallization experiments. Then diffraction patterns were collected using synchrotron radiation and maximum resolution was obtained in the diffraction data of F359G variant that achieves 1.1Å resolution.The structures were solved by molecular replacement allowing to verify that the global characteristic topology of the DyP family is conserved. The structure is formed by two domains, each of them include helices and antiparallel strains, these sheets of each domain are packed against each other, forming a barrel. The enzyme mutations cause a heme pocket enlargement, more significant in the F359G variant while in L357G variant a wider channel opening at the protein surface was observed. These results together with those obtained in catalytic activity assays and computational simulations indicate that the direct sulfoxidation capacity of the F359G and L357G variants is due a better access of the substrates to the reactive heme cofactor, showing more favorable interaction energies. In addition, studies of the sulfoxidation reaction products shows that F359G is highly stereoselective with up to 99% excess of the S enantiomer. 2+ 3+DyP4 produced by P. ostreatus is able to oxidize Mn to Mn in the presence of H2O2. The catalytic efficiency of this reaction is similar to the one reported in manganese peroxidases (MnP) and in versatile peroxidases (VPs) from this and other white–rot fungi members. To identify the electron transfer pathway involved in the manganese oxidation and due to the absence of a structural model, a set of mutants was designed: E190A, F194W, F194Y, D196A, D215A, Y339A, E345A, D352A, D354A, D352A/D354A and E345A/D352A/D354A. These variants present mutations in aromatic and acidic residues (phenylalanine, tyrosine, aspartic or glutamic acids) that are located in the heme propionates environment. All variants and the wild–type enzyme were cloned into pET15b vector adding a His–tag at the N–terminal end, followed by their expression in E. coli and their purification by affinity chromatography (Ni–NTA column). Crystals of wild–type PleosDyP4 and four of its mutants (E190A, F194W, F194Y and D196A) were obtained by vapour diffusion experiments and the diffraction patterns were collected using synchrotron radiation. The structures were solved by molecular replacement; it allowed the identification of two domains formed by helices and antiparallel strains that adopt a ferredoxin–like folding with the heme cofactor located at the C–terminal domain. Co–crystallization experiments with manganese have allowed to identify its union site in the surface of protein. This information in addition to the catalytic activity assays and the computational 2+simulations, establish that Glu345 is involved in the initial electron transfer from Mn to Tyr339. To summarize, the structures of two variants of DyP1 from A. auricula–judae, L357G and F359G in addition to catalytic activity studies and computational simulations have allowed to determine the sulfoxidation mechanism of thioanisole (methyl phenyl sulfide) and methyl p–tolyl sulfide. Likewise, high stereoselectivity has been reported in F359G mutant with possible applications in organic synthesis of high added-value. With reference to DyP4 from P. ostreatus, the first structural models have been 2+obtained allowing to characterize the molecular mechanism involved in Mn oxidation, this skill has not been reported before for any other fungal DyP. These structural models provide the basis for the most recent research on new fungal DyP in which manganese oxidation is reported.[ES]Las hemo peroxidasas son proteínas que catalizan reacciones de óxido–reducción, de una gran variedad de sustratos, en presencia de peróxido de hidrógeno. Las peroxidasas de tipo DyP, también denominadas peroxidasas decolorantes de tinte (“dye–decolorizing peroxidases”), son hemo peroxidasas presentes en bacterias, arqueas, protistas y hongos, con una gran diversidad de secuencia. Estas enzimas se caracterizan por su gran estabilidad frente a las condiciones más extremas de pH, temperatura y presión. Catalizan la oxidación de sustratos muy variados entre los que se encuentran compuestos poco biodegradables como la lignina o los colorantes antraquinónicos y azoicos, actividad que da nombre a este peculiar grupo. Su gran estabilidad y su actividad catalítica frente a sustratos poco biodegradables ha suscitado un gran interés en el campo de la biotecnología, con aplicaciones en ámbitos tan variados como la biorremediación de medios contaminados por residuos industriales, la producción de biocombustibles, el tratamiento de materias primas para uso industrial o la síntesis orgánica de compuestos. En esta tesis, en colaboración con el grupo de Biotecnología para la Biomasa Lignocelulósica del Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC), se han resuelto las estructuras de dos enzimas de hongos basidiomicetos de la podredumbre blanca, pertenecientes a las peroxidasas de tipo DyP: DyP1 de Auricularia auricula–judae y DyP4 de Pleurotus ostreatus. En estudios previos de DyP1 de A. auricula–judae se resolvieron las estructuras de la enzima nativa y de una serie de mutantes que, junto a los ensayos de actividad enzimática, permitieron determinar la ruta de transferencia electrónica de largo alcance desde residuos aromáticos de la superficie (triptófanos y tirosinas) hasta el grupo hemo para la oxidación de sustratos voluminosos. Con esta información decidimos diseñar mutaciones que afectaran al canal de acceso al grupo hemo, con el objetivo de hacer más accesible este bolsillo y permitir el paso de sustratos poco voluminosos. Para ello, se diseñaron dos mutantes L357G y F359G ubicados en la entrada del canal de acceso al centro activo. La enzima nativa y sus dos mutantes se clonaron en el vector pET23a, se expresaron en E. coli y se purificaron, previo replegado “in vitro”, mediante cromatografía de intercambio iónico. Se realizaron análisis cinéticos y computacionales, y en los ensayos de cristalización se obtuvieron cristales de calidad suficiente para acometer su resolución estructural. Se recogieron los datos de difracción empleando radiación sincrotrón, alcanzándose en el caso del mutante F359G una resolución de 1.1 Å. Las estructuras se resolvieron mediante reemplazo molecular, pudiéndose comprobar que todas ellas conservan la topología característica de las DyPs, con dos dominios que contienen hélices y láminas antiparalelas que forman un barril. Los cambios más notables se observaron en la región donde se introdujeron las mutaciones con una ampliación del bolsillo hemo, más significativo en el mutante F359G mientras que para L357G se observó un aumento en el diámetro del canal de acceso a la cavidad. Estos resultados, junto con los obtenidos en los ensayos de actividad enzimática y las simulaciones computacionales, han podido explicar que la capacidad de sulfoxidación de los mutantes se produce por un mejor acceso del sustrato al cofactor hemo, con unas energías de interacción más favorables. Además, el análisis de los productos de esta reacción de sulfoxidación muestra la alta estereoselectividad observada para el mutante F359G, con hasta un 99% de exceso del enantiómero S.La peroxidasa de tipo DyP (DyP4) de P. ostreatus cataliza la oxidación de Mn a 3+Mn , en presencia de H2O2, con una eficiencia similar a la descrita en peroxidasas de manganeso (MnPs) y peroxidasas versátiles (VPs) de éste y otros hongos de podredumbre blanca. Como no se disponía de ningún modelo estructural, con el objetivo de identificar la ruta de transferencia electrónica implicada en la oxidación del manganeso se abordó la resolución de la estructura tridimensional de la enzima DyP4 en su forma nativa, y se diseñó una batería de mutantes basados en la información estructural disponible de peroxidasas que presentan esta actividad enzimática. Las mutaciones afectan a residuos aromáticos (fenilalanina y tirosina) y residuos ácidos (aspárticos y glutámicos): E190A, F194W, F194Y, D196A, D215A, Y339A, E345A, D352A, D354A, D352A/D354A y E354A/D352A/D354A. Estos mutantes y la enzima nativa se clonaron en el vector pET15b, que añade una cola de histidinas en el extremo N–terminal, se expresaron en E. coli y se purificaron mediante cromatografía de afinidad (columna de Ni–NTA). Se obtuvieron cristales de la proteína nativa PleosDyP4 y de cuatro de los mutantes (E190A, F194W, F194Y y D196A) mediante técnicas de difusión de vapor y se recogieron los datos de difracción empleando radiación sincrotrón. Las estructuras se resolvieron por reemplazamiento molecular, permitiendo la identificación de dos dominios que contienen hélices y láminas antiparalelas y que presentan un plegamiento tipo ferredoxina, el cofactor hemo se aloja en el dominio C– terminal. Ensayos de cocristalización con manganeso han permitido establecer su sitio de unión en la superficie enzimática. Esta información junto a los resultados obtenidos en los ensayos de actividad y simulaciones computacionales confirman la importancia del 2+Glu345 y la Tyr339 en la transferencia de electrones inicial del Mn . En conclusión, en este trabajo se presentan las estructuras de dos mutantes (L357G y F359G) de la enzima DyP1 de A. auricula–judae que, junto a ensayos de actividad enzimática y simulaciones computacionales, han permitido determinar el mecanismo de reacción de sulfoxidación del tioanisol (metil–fenil sulfuro) y del metil p–tolil sulfuro. Además, se ha observado una alta estéreoselectividad del mutante F359G, actividad con posibles aplicaciones en síntesis orgánica de valor añadido. En el caso de DyP4 de P. ostreatus se han obtenido los primeros modelos estructurales que han permitido caracterizar el mecanismo molecular implicado en la oxidación de 2+Mn de la primera DyP fúngica que presenta esta actividad. Los modelos estructurales pueden servir de base a los estudios más recientes, realizados en nuevas DyP fúngicas en las que se está detectando actividad frente a manganeso.Peer reviewe