Crioconservación de especies forestales atlánticas: desarrollo de bancos de germoplasma de castaño y alcornoque

Trabajo presentado en el Seminario Sobre Biodiversidad Vegetal en el Sistema Agroforestal Atlántico (AGROFOR), celebrado en Pontevedra (España), del 27 al 28 de octubre de 2010El castaño europeo (Castanea sativa Mill.) y el alcornoque (Quercus suber L.) son especies forestales de gran importancia económica, ecológica y social que en la actualidad se encuentran amenazadas tanto por la actividad humana como por el ataque de patógenos. Para el mantenimiento de la diversidad genética de estas especies es necesario diseñar estrategias de conservación, tanto in situ como ex situ. Dentro de los sistemas de conservación ex situ, y englobada en las técnicas de cultivo in vitro de tejidos, se encuentra la crioconservación [la conservación del material vegetal en nitrógeno líquido (NL)], que es un método seguro y económico para el mantenimiento a largo plazo de germoplasma de especies que son propagadas vegetativamente o que tienen semillas recalcitrantes al almacenamiento convencional. Las condiciones indispensables para iniciar un proceso de crioconservación son disponer de a) un sistema de acondicionamiento de las células de los tejidos a crioconservar para evitar la formación intra e intercelular de cristales de hielo, y b) un sistema de regeneración de plantas factible y repetitivo, que permita la recuperación de plantas completas después de que las células, órganos o tejidos hayan estado inmersos en NL. En castaño y alcornoque se cumplen ambas condiciones ya que las metodologías para la crioconservación de embriones somáticos de alcornoque (Valladares et al., 2004) y de ápices caulinares de castaño (Vidal et al., 2005) han sido desarrollada en el Instituto de Investigaciones Agrobiológicas de Galicia. Por otra parte, la empresa pública TRAGSA trabaja desde el año 2000 en la selección y desarrollo de materiales de especies frondosas de alto valor económico, como el castaño y el alcornoque, para su propuesta al Catálogo Nacional de Materiales de Base. El presente trabajo ha consistido en la transferencia de la tecnología de crioconservación, adaptándola a las necesidades de la empresa, con el objetivo de desarrollar por primera vez bancos de germoplasma aplicados de ambas especies.Se han utilizado 46 clones de castaño de origen adulto y establecidos in vitro en el Departamento de Mejora Agroforestal de TRAGSA en Maceda (Ourense). Estos genotipos fueron seleccionados en campo por sus características de aparente resistencia a la enfermedad de la tinta. Por otra parte, se utilizaron 51 líneas embriogénicas de alcornoque establecidas a partir de árboles seleccionados por su forma, tamaño, condición fitosanitaria y calidad del corcho, localizados en 15 rodales selectos de 4 regiones de procedencia de Extremadura. Para el cultivo y crioconservación de castaño se ha seguido el método descrito por Vidal et al. (2005). Previamente a su aplicación a los genotipos seleccionados, se realizaron estudios destinados a evaluar a) la estabilidad genética tras la crioconservación utilizando RAPDs, y b) el efecto de la adición del Supercool X-1000 (SC) a la disolución crioprotectora (Vidal et al., 2010). En el alcornoque se ha seguido el método de Valladares et al. (2004), evaluándose además el uso de placas con papel de filtro durante las 24 horas siguientes a la descongelación y la influencia de la duración del periodo de precultivo en sacarosa 0,3 M sobre los porcentajes de recuperación de la capacidad embriogénica (Vidal et al., 2008), a fin de facilitar la simplificación del protocolo y su adaptación a la empresa.Los resultados obtenidos indican que la respuesta a la crioconservación en ambas especies, como muchas otras características de las especies leñosas, depende en gran medida del genotipo. En castaño, el análisis mediante RAPDs no revela modificaciones genéticas en las plantas obtenidas a partir de los ápices caulinares crioconservados. Por otra parte, se ha observado que la adición de 0,1% de SC a la disolución crioprotectora PVS2 mejora los porcentajes de supervivencia en 6 de los 8 clones utilizados en dicho estudio y que la aplicación de SC duplica los valores de recuperación de brotes en 5 de los 6 clones que los forman. Por tanto, este compuesto se utilizó en la crioconservación de los 46 clones que constituyen el banco de germoplasma, obteniéndose la supervivencia del material en 43 de ellos y recuperación de brotes en 29 genotipos. En alcornoque, se ha simplificado el protocolo de crioconservación original y se ha obtenido la recuperación de la capacidad embriogénica en los 51 genotipos objeto de estudio, aunque de nuevo se observan diferencias genotípicas ya que las frecuencias de formación de embriones secundarios oscilan entre 18 y el 100% en los distintos clones crioconservados.Se han establecido dos bancos de germoplasma, uno de castaño y otro de alcornoque, a los que se continúan añadiendo nuevos genotipos. De los 46 genotipos caracterizados en castaño, el 93% ha mostrado alta capacidad de supervivencia y el 63% capacidad de recuperación de brotes. El banco de alcornoque está constituido hasta el momento por 51 genotipos y todos ellos muestran alta capacidad de recuperación de embriones. Estos resultados confirman la posibilidad de utilizar la crioconservación para conservar a largo plazo germoplasma de estas especies.Esta investigación ha sido financiada parcialmente por los proyectos CIT-010000-2007-5 (Ministerio de Educación y Ciencia) y PGDIT07MRU003E (Xunta de Galicia).Peer reviewe