Effects of the presence of seminal plasma on the integrity of membranes, chromatin and cytoskeleton of bull spermatozoa

Muitos dos protocolos de congelação utilizados ainda hoje são empíricos com cerca de 40 a 50% de espermatozoides não sobreviventes ao processo e aqueles que sobrevivem são afetados estrutural ou funcionalmente após a descongelação. Ademais, existem controversas quanto aos efeitos do plasma seminal no processo de congelação, podendo ser benéfico quanto a capacitação ou deletério quanto ao armazenamento e criopreservação espermática. Definir o efeito da retirada do plasma seminal em cada etapa do processo de congelação, assim como o momento mais crítico e prejudicial aos espermatozoides seria importante para o avanço da criopreservação do sêmen bovino. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da remoção do plasma seminal e do processo de congelação sobre a integridade de membranas plasmática e acrossomal, potencial de membrana mitocondrial, remodelação dos filamentos de actina do citoesqueleto e fragmentação de cromatina espermática durante a refrigeração, período de equilíbrio e congelação/descongelação. Para isso, cada ejaculado foi dividido em duas alíquotas (com plasma seminal= PS e sem plasma seminal= SPS) com concentração final de 50x106 esptz/palheta, envasadas em palhetas de 0.5mL e acondicionadas em uma máquina de congelação automática com porta-palhetas vertical. Foram realizadas 41 colheitas de 7 touros da raça Nelore. Os dados obtidos dos procedimentos experimentais foram analisados com auxílio do software Statistical Analysis for Windows SAS®, versão 9.3 (SAS 2005). Houve efeito das etapas do processo de congelação para todas as características estudadas exceto fragmentação de cromatina. A presença plasma seminal preservou melhor a integridade acrossomal e também proporcionou menor remodelação dos filamentos de actina do citoesqueleto (75.2% e 71.7%; 29.9% e 32.4%, respectivamente) que a sua ausência no processo de congelação. A refrigeração induziu maior remodelação de F-actina que as etapas de período de equilíbrio e congelação/descongelação (56.3%, 32.2% e 23.9%, respectivamente). A congelação/descongelação é a etapa em que há mais danos no processo de congelação para as características avaliadas pois, há o acúmulo das injúrias causadas pelas etapas anteriores ao longo do processo (P<0.05). Concluímos que a presença do plasma seminal preserva melhor a integridade acrossomal e proporciona menor remodelação dos filamentos de actina do citoesqueleto espermático que a ausência do plasma seminal, entretanto, a presença ou ausência do plasma seminal tem pouca influência sobre a membrana plasmática, potencial de membrana mitocondrial e nenhum impacto sobre a cromatina espermática.Many of the freezing protocols used today are empirical with about 40 to 50% nonsurviving spermatozoa and those that survive are structurally or functionally affected after thawing. Moreover, there are controversies regarding the effects of seminal plasma on the freezing process, which may be beneficial for capacitation or deleterious for sperm storage and cryopreservation. Defining the effect of seminal plasma withdrawal at each stage of the freezing process, as well as the most critical and damaging moment for spermatozoa would be important for the advancement of bovine semen cryopreservation. The aim of this study was to evaluate the effect of seminal plasma removal and freezing process on plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial membrane potential, remodeling of cytoskeleton actin filament and sperm chromatin fragmentation during cooling, equilibration period and freezing/thawing. For this, each ejaculate was divided into two aliquots (with seminal plasma = PS and without seminal plasma = SPS) with a final concentration of 50x106 sptz/straw, packed in 0.5mL straws and put in an automatic freezer machine with vertical straw holder. Forty-one ejaculates were collected out from 7 Nelore bulls. Data obtained from the experimental procedures were analyzed with the aid of Statistical Analysis for Windows SAS® software, version 9.3 (SAS 2005). The presence or absence of seminal plasma did not differ significantly in any of the characteristics studied. The presence of seminal plasma better preserved acrosomal integrity and also provided less remodeling of cytoskeleton actin filaments (75.2% and 71.7%; 29.9% and 32.4%, respectively) than its absence in the freezing process. Refrigeration induced greater F-actin remodeling than the equilibrium period and freezing/thawing steps (56.3%, 32.2% and 23.9%, respectively). Freezing/thawing is the stage where there is more damage to the freezing process for the evaluated characteristics, since there is accumulation of injuries caused by the previous steps throughout the process (P<0.05). In conclusion, the presence of seminal plasma better preserves acrosomal integrity and provides less remodeling of spermatic cytoskeleton actin filaments than the absence of seminal plasma; however, the presence or absence of seminal plasma has little influence on plasma membrane, membrane potential. mitochondrial and no impact on sperm chromatin