The role of Rboh-mediated ROS and glutathione in plant-nematode interaction

Aerobic life forms are known for constant production of reactive oxygen species (ROS), the deleterious end-products of aerobic energy that are able to provoke cellular damage. The ROS production in plants can be triggered by various kinds of abiotic stresses and pathogen attack. One of the earliest and vital aspects of a plant's defence strategy is oxidative burst, which is a rapid and transient release of large amounts of ROS. In plants, pathogen-induced ROS are mainly generated by plasma membrane-bound NADPH oxidases called respiratory burst oxidase homolog (Rboh) that resemble the mammalian NADPH oxidase catalytic subunit gp91phox. In Arabidopsis, Rboh is encoded by ten genes (hereafter called 'RbohA-RbohJ'). In plant-pathogen interactions, Rboh-mediated ROS have a sophisticated, pathosystem-specific role; however, the mechanistic details are still unknown. ROS are toxic to cells at high concentrations and thus a fine-tuned balance between ROS production and their detoxification is needed for efficient plant metabolism and functions under optimal as well as stress conditions. The most abundant and ubiquitous non-protein thiol, glutathione is regarded as the master antioxidant for counteracting the toxic effects of ROS. Residing at the centre of a complex antioxidant network in plants, it also maintains a tight control of the redox status and mediates many other physiological conditions including cellular signaling. In most plant-pathogen interactions, glutathione act as negative regulator of pathogenicity but the role of glutathione during the infection of plants by root-parasitic nematodes is largely unresolved. The aim of this study was to explore the mechanism by which NADPH oxidases promotes plant infection by examining the plant response to nematodes and to decipher the mechanism how glutathione modulates plant responses to nematode infection using Arabidopsis thaliana-Heterodera schachtii model system. Plant-parasitic nematodes are a major agricultural threat to almost all economically important crops, causing billions of dollars of losses world wide. Most of this damage is caused by a small group of root-infecting sedentary endoparasites including the beet cyst nematode H. schachtii. Infective-stage juveniles (J2s) of the nematode invade the roots and establish a biotrophic relationship through inducing a neoplastic syncytial nurse cells that functions as their sole nutrient source. In our previous work, we found that the invasion by cyst nematode causes tissue damage in the host roots triggers Rboh-mediated ROS production. Surprisingly, Arabidopsis mutants, rbohD/F lacking ROS production have been shown to be less susceptible to cyst nematode infection. To decipher the mechanism underlying Rboh-mediated nematode susceptibility, we performed a comparative hormone profiling as well as genome-wide transcriptome analysis between Col-0 and rbohD/F during the early stages of nematode infection. We identified Walls Are Thin 1 (WAT1) gene, which encodes a vacuolar auxin transporter, as the gene that was most strongly downregulated in rbohD/F. Genetic disruption of WAT1 resulted in a nematode-resistant phenotype that was comparable to rbohD/F, thus suggesting that Rboh-mediated resistance to nematodes is linked to WAT1. Further analysis revealed a link between Rboh-linked nematode resistance and auxin metabolism in infected tissues. Thus, we conclude that H. schachtii stimulate NADPH oxidase in plants to produce ROS that in turn activate the expression of WAT1 to mediate auxin transport needed for its development. Glutathione biosynthesis in plants is mediated by the functions of two ATP-dependent enzymes γ-glutamyl-cysteine synthetase and glutathione synthetase, encoded by GSH1 and GSH2 genes, respectively. The induction of these genes in both migratory and sedentary stages of infection underpins the function of glutathione in cyst nematode parasitism. We found that mutations in GSH1 results different mutant alleles that accumulate differentially altered cysteine and glutathione amounts independent of cyst nematode infection. However, depletion of glutathione level leads to enhanced susceptibility in pad2-1, cad2-1and zir1 and reduced susceptibility in rax1-1 to nematode infection. Analysis of redox-sensitive green fluorescent protein (roGFP) probe revealed that the expression of GRX1-roGFP2 significantly reduced in pad2-1 but increased in rax1-1 during early stage of infection, indicating a clear oxidative shift of the cytosolic glutathione redox potential. Further analysis shows that camalexin accumulation negatively affects plant susceptibility to nematode infection. Thus, our results demonstrate the importance of glutathione to orchestrate plant defense via regulating cellular redox homeostasis and camalexin production against cyst nematode infection.Alle Formen aeroben Lebens produzieren Reaktive Sauerstoffspecies (ROS), Endprodukte der aeorben Energiegewinnung, die schwere Schäden an Zellen verursachen können. Die Produktion von ROS in Pflanzen kann darüber hinaus durch verschiedene Formen von abiotischem Stress und Pathogenbefall ausgelöst werden. Einer der frühesten und wichtigsten Aspekte der pflanzlichen Stressabwehr ist der sogenannte "Oxidative Burst", der durch eine schnelle und transiente Freisetzung großer Mengen ROS gekennzeichnet ist. In Pflanzen werden pathogeninduzierte ROS hauptsächlich durch an die Plasmamembran gebundene NADPH Oxidase generiert, die Respiratory Burst Oxidase Homolog (Rboh), die der katalytischen Untereinheit gp91phox der säugerspezifischen NADPH Oxidase entspricht. InArabidopsis wird Rboh durch zehn Gene kodiert ('RbohA bis RbohJ'). In Pflanze-Pathogen- Interaktionen scheinen durch Rboh gebildete ROS eine komplex gesteuerte und pathosystemspezifische Funktion zu haben. Allerdings sind die mechanistischen Details bisher nicht bekannt. Tatsächlich sind ROS in hohen Konzentrationen toxisch für Zellen. Daher ist eine fein gesteuerte Balance zwischen ROS-Produktion und Detoxifizierung notwendig, um einen effizienten Stoffwechsel der Pflanze unter optimalen Bedingungen wie auch Stress zu gewährleisten. Das häufig vorkommende und ubiquitäre Tripeptid Glutathion ist das wichtigste Antioxidans, das den toxischen Effekten der ROS entgegenwirkt. Es steht im Zentrum eines komplexen antioxidativen Netzwerkes, kontrolliert den Redoxstatus der Zellen und beeinflusst viele andere physiologischen Funktionen einschließlich des zellulären Signalaustausches. In den meisten untersuchten Pflanze-Pathogen-Interaktionen agiert Glutathion als negativer Regulator der Pathogenität. Seine Rolle während der Infektion von Pflanzen durch wurzelparasitäre Nematodes ist dagegen noch weitgehend unbekannt. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Mechanismen zu untersuchen, durch die NADPH Oxidasen die Pathogeninfektion fördern und mit Hilfe derer Glutathion die Reaktionen der Pflanze auf Nematodeninfektionen reguliert. Für die Untersuchungen wurde das Modellsystem Arabidopsis thaliana-Heterodera schachtii verwendet. Pflanzenparasitäre Nematoden sind bedeutende Schadfaktoren bei der Produktion nahezu aller wichtigen Nutzpflanzen und sie verursachen weltweit Verluste in Milliardenhöhe. Die meisten Schäden werden von einer kleinen Gruppe von wurzelparasitären, sedentären Endoparasiten verursacht, die auch den Rübenzystennematoden H. schachtii einschließt. Infektionslarven (J2) der Nematoden dringen in die Wurzel ein und etablieren eine IV biotrophische Beziehung, in dem sie ein neoplastisches Nährzellensystem etablieren, das als einzige Nahrungsquelle dient. In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass das Eindringen von Zystennematoden in die Wurzel Gewebeschäden verursacht, die zur Rboh-vermittelten Produktion von ROS führen. Überraschenderweise erwiesen sich Arabidopsis-rbohD/F-Mutanten, ohne ROS Produktion als weniger anfällig für Zystennematoden. Um das Phämomen der Rboh-vermittelten Anfälligkeit zu analysieren, wurden vergleichende Pflanzenhormon- und Transkriptomanalysen mit dem Wildtyp und der rbohD/F Mutante im frühen Infektionsstadium durchgeführt. Dabei konnten wir das "Walls Are Thin 1" (WAT1) Gen, das für einen vakuolären Auxintransporter kodiert, als das in der Mutante am stärksten abregulierte Gen identifizieren. Die WAT1 Mutante zeigte einen ähnlich resistenten Phänotyp wie rbohD/F, was darauf hindeutet, dass es einen funktionellen Zusammenhang zwischen beiden Genen gibt. Weitere Analysen bestätigten den Zusammenhang zwischen Rboh-vermittelter Anfälligkeit und dem Auxin-Metabolismus des infizierten Gewebes. Daher schlussfolgern wir, dass H. schachtii die NADPH Oxidase in Pflanzen dazu anregt ROS zu produzieren, die ihrerseits die Expression von WAT 1 auslösen, um den für die weitere Entwicklung notwendigen Auxintransport zu gewährleisten. Die Glutathion-Biosynthese in Pflanzen wird durch die Funktion der zwei ATP-abhängigen Enzyme γ-Glutamyl-Cystein Synthetase und Glutathion Synthetase, kodiert durch die Gene GSH1 und GSH2. Die Induktion dieser Gene im Verlauf der beweglichen wie sedentären Entwicklungsphase unterstreicht ihre Bedeutung bei der Parasitierung der Pflanze durch Zystennematoden. Wir konnten zeigen, dass verschiedene Mutationsallele von GSH1 unterschiedlich veränderte Mengen von Cysteine and Glutathion unabhängig vom Nematodenbefall akkumulieren. Die Absenkung des Glutathionspiegels führte allerdings zu einer gesteigerten Anfälligkeit in pad2-1, cad2-1 and zir1 und einer reduzierten Anfälligkeit in rax1-1. Die Analyse mit einem redoxsensitiven Green Fluorescent Protein (roGFP) zeigte, dass die Expression von GRX1-roGFP2 in pad2-1 signifikant reduziert, aber in rax1-1 deutlich erhöht war. Dies weist auf einen klare Verschiebung des cytosolischen Glutathion Redoxpotentials hin. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Camalexinanreicherung die Anfälligkeit von Pflanzen gegenüber Nematoden reduziert. Die Ergebnisse zeigen, dass Glutathion eine wichtige Rolle in der Feinsteuerung der Pflanzenabwehr gegen Nematoden spielt, in dem es die zelluläre Redoxhomöostase und die Produktion von Camalexin kontrolliert