Caracterização e potencial imunomodulatório de vesículas extracelulares de células dendríticas tratadas com catelicidina LL-37

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2019.As vesículas extracelulares (VEs) derivadas de células dendríticas (DCs) têm atraído atenção pela sua atividade na indução de repostas imunológicas específicas. Essas nanomoléculas secretadas por diferentes tipos celulares, em particular aquelas derivadas de DCs, são delimitadas por bicamada lipídica e estão relacionadas com a apresentação antigênica aos linfócitos T por meio da expressão de MHC e moléculas coestimulatórias em sua superfície vesicular. Durante o seu desenvolvimento, as DCs imaturas sofrem estímulos que influenciam no seu estado de maturação, tais como citocinas e peptídeos antimicrobianos. A catelicidina LL-37 é um peptídeo antimicrobiano predominante em ambientes inflamatórios e com capacidade imunomodulatória, incluindo a de promover a plasticidade do estado de diferenciação de DCs. Entretanto, não há relato na literatura se o estímulo da LL-37 sob as DCs reflete no perfil de VEs secretadas por essas células. Nesse sentido, o objetivo do presente estudo foi caracterizar funcionalmente VEs derivadas de DCs induzidas por LL-37. Inicialmente, as DCs foram obtidas a partir da medula óssea de camundongos (BMDCs), expostas com LL-37, durante e após a sua diferenciação, para a verificação da sua atividade funcional por meio da dosagem das citocinas TNF-α, IL-6, IL-12p70, IL-10, IL-1β e a quimiocina CCL2, por teste imunoenzimático ELISA. As VEs (VE-LL-37) foram então, obtidas do sobrenadante das culturas celulares das BMDCs e purificadas por ultracentrifugação diferencial e, em seguida caracterizadas quanto ao tamanho e distribuição, por técnica de resistência de pulso (tRPS) e quanto a morfologia, por microscopia eletrônica (MET). Inicialmente, as VE-LL-37 induziram a produção de citocinas, incluindo a IL-12, tanto em DCs como em macrófagos. Além disso, a interação dessas VEs com linfócitos T alogênicos levou a ativação MHC-dependente dessas células com produção de IFN-γ, sugestivo de fenótipo T1. Na reação mista de leucócitos utilizando o modelo de infecção in vitro de BMDCs por Paracoccidioides brasiliensis, o tratamento desses fagócitos com VE-LL-37 levou a reversão de um perfil T2, induzido pelo fungo, para T1. Finalmente, utilizando macrófagos infectados pelo P. brasiliensis verificamos, ao avaliar a viabilidade fúngica, a produção de NO- e TNF-α, que as VEs não têm a capacidade de modular as células infectadas. Os achados preliminares nesse estudo contribuem para a compreensão dos efeitos imunomodulatórios, na produção de citocinas e indução da resposta predominante T1, pelos quais as VEs derivadas de DCs estimuladas por LL-37 influenciam as respostas imune inata e adaptativa, abrindo novas possibilidades do uso de VEs no controle das respostas imunológicas, seja como terapia ou adjuvante em tratamentos imunomoduladores.Extracellular vesicles (EVs) derived from dendritic cells (DCs) have attracted attention for their ability to induce specific immune responses. These nanomolecules released by different cell types, specially DCs, are lipid bilayer-delimited and are related to antigenic presentation to T lymphocytes by MHC and costimulatory molecules expression on their surface. During their development, immature DCs sense environment cues that influence their maturation state, such as cytokines and antimicrobial peptides. Cathelicidin LL-37 is an antimicrobial peptide predominantly found in inflammatory environments and with immunomodulatory capacity, including the promotion of DCs differentiation state plasticity. However, there is no report in the literature describing EVs derived from LL-37-treated DCs. In this sense, the aim of the present study was to functionally characterize DCs-derived EVs induced by LL-37. Initially, DCs were obtained from mouse bone marrow (BMDCs), exposed with LL-37, during and after its differentiation, that induced the production of proinflammatory cytokines TNF-α, IL -6, IL-12p70, and chemokine CCL2, by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The EVs (EV-LL-37) were obtained from the supernatant of these cells and purified by differential ultracentrifugation and then characterized by size and distribution by pulse resistance technique (tRPS) and morphology by Transmission Electron Microscopy (MET). EV-LL-37 was capable of inducing cytokines secretion, including IL-12, in both DCs and macrophages. In addition, the interaction of these EVs with allogeneic T lymphocytes led to the MHC-dependent activation of these cells with IFN-γ production, suggestive of T1 phenotype. In the mixed leukocyte reaction using the model of in vitro infection of BMDCs by Paracoccidioides brasiliensis, the treatment of these phagocytes with EV-LL-37 led to the reversion of a predominant T2 to T1 profile. Finally, employing macrophages infected with P. brasiliensis, we verified that EV-LL-37 did not modulate the fungicidal activity of these macrophages. Accordingly, NO- and TNF-α production, by these phagocytes were not affected by the presence of EV-LL-37. Preliminary findings in this study contribute to the understanding of immunomodulatory effects on cytokine production and induction of the predominant T1 response, in which EVs derived from DCs stimulated by LL-37 influence innate and adaptive immune responses, opening new possibilities for the use of EVs in the control of immunological responses, either as therapy or adjuvant in immunomodulatory treatments