Prospecção e análises de superfícies para imobilização de biomoléculas

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2014.A escolha de um suporte adequado representa uma etapa primordial e essencial para investigações em imobilização de biomoléculas. Para tanto, é necessário o conhecimento detalhado da estrutura e propriedades dos suportes. Nesse estudo, foram escolhidos três tipos de suportes: superfícies de polipropileno (PP), membranas poliméricas porosas (nitrocelulose, nylon, PVDF e PTFE) e esferas de sílica, com o objetivo de caracterizar suas superfícies, qualitativa e quantitativamente em nível nanométrico, para posterior imobilização de biomoléculas. Dentre esses materiais, as superfícies de sílica modificada pelo processo de silanização, e as superfícies de PP modificadas com polianilina apresentaram maior potencial de aplicações no desenvolvimento de dispositivos para processos biotecnológicos. As membranas poliméricas porosas, além de terem sido caracterizadas quimicamente por meio de análises de FTIR e EDS, foram caracterizadas por meio da técnica de espectroscopia de força para verificação de suas propriedades mecânicas, atrativas, adesivas e elásticas. Essas membranas não foram utilizadas como suportes para imobilização de enzimas e biomoléculas devido à algumas propriedades indesejáveis, tais como propriedades atrativas muito baixas e dificuldade no manuseio desses materiais. As esferas de sílica foram modificadas quimicamente por silanização com APTS (3-aminopropil-trietoxisilano), o que resultou em um aumento significativo da rugosidade desse sistema. Partículas de sílica normal e silanizada foram testadas, com o uso de planejamento experimental do tipo composto central (PCC), em ensaios de imobilização de tripsina. A imobilização de tripsina em sílica normal e silanizada, que foi quantificada por meio de cromatografia líquida de alta eficiência, possibilitou a observação de uma elevada eficiência de imobilização de tripsina nas sílicas testadas (entre 80 e 98 %). Ambas apresentaram regiões de elevada eficiência de imobilização nos extremos de tempo, porém, foi observado uma restrição da faixa de valores de pH das zonas de maior eficiência de imobilização para a sílica silanizada. Os microtubos de PP funcionalizados com polianilina (PANI) foram aplicados para a imobilização de biomoléculas, sendo que para a tripsina imobilizada covalentemente, foi possível a reutilização em até 20 ciclos com retenção e manutenção de aproximadamente 60% da atividade inicial. Na imobilização por adsorção foi possível a reutilização do sistema contendo a enzima imobilizada por adsorção por 9 ciclos com manutenção acima de 60% de retenção da atividade inicial. A superfície de PP funcionalizada com PANI foi capaz de reduzir íons prata em solução, resultando na síntese de nanopartículas de prata com raio hidrodinâmico menor que 50 nm. Esse sistema foi capaz de atuar na captura/remoção de íons ferro em solução. A exposição de uma solução de nitrato de prata ao ambiente químico gerado pela funcionalização do microtubo de PP com PANI contendo biomoléculas imobilizadas por adsorção ou covalentemente (extrato de levedura, Fermipan® ou levedo de cerveja), propiciou a produção de nanopartículas de prata com raio hidrodinâmico menor que 100 nm e polidispersividades (PDI) mais baixas. A caracterização em nanoescala utilizando as abordagens descritas nessa Tese pode então ser apontada como uma ferramenta essencial na elucidação das propriedades do microambiente gerado pela imobilização de biomoléculas.The choice of a suitable support is a primary and essential step for investigations concerning biomolecules immobilization. It requires a deep knowledge about the supports structure and properties. In this study, were selected three kinds of supports: polypropylene (PP) surfaces, polymeric porous membranes (nitrocellulose, nylon, PVDF and PTFE) and silica spheres, aiming the characterization of their surfaces qualitatively and quantitatively at the nanometer level, to subsequent immobilization of biomolecules. Among the tested materials, silica spheres chemically modified by silanization with APTS (3-aminopropyl-trietoxisilane) and PP surfaces modified with polyaniline (PANI) presented great potential for applications in the development of new devices for use in biotechnological processes. Polymeric porous membranes were chemically characterized by FTIR and EDS analyses. They were also characterized by single point force spectroscopy technique for verification of their attractive, adhesive, and elastic physical properties. These membranes were not used as supports for immobilization of enzymes and biomolecules due to some undesirable properties such as very low attractive tendencies and difficulties on handling these materials. Chemically modified silica spheres resulted in an increased roughness. Normal and APTS-modified silica particles were tested for trypsin immobilization, after applying the central composite experimental design (PCC). Trypsin immobilization onto normal and silanized silica, measured by high performance liquid chromatography, showed out a high efficiency of enzyme immobilization (between 80 and 98%). Both systems showed high efficiency of immobilization in extreme pH conditions. However, it was observed a restriction of the range of pH values of the regions with high immobilization efficiency for silanized silica. PP surface functionalized with PANI was capable of reducing silver ions in solution, resulting in the synthesis of silver nanoparticles smaller than 50 nm in hydrodynamic radius. This system was capable of acting in the capture/removal of iron ions in solution. Exposure of a silver nitrate solution to the chemical environment generated by functionalization of PP microtube funcionalized with PANI containing immobilized biomolecules by adsorption or covalently (yeast extract, Fermipan®), enable to the production of silver nanoparticles with radius hydrodynamic less than 100 nm and lower polydispersities (PDI). The nanoscale characterization using the approaches described in this PhD Thesis can then be identified as an essential tool in the elucidation of the microenvironment properties generated by immobilization of biomolecules