Estudo do exportoma de Plasmodium falciparum nos estágios eritrocitários tardios

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2019.A malária é considerada a parasitose mais grave e o Plasmodium falciparum é a espécie responsável pelo maior número de mortes. O desenvolvimento de novos fármacos requer o conhecimento da biologia do parasito, das suas proteínas essenciais e de como elas interagem entre si. O P. falciparum exporta proteínas para a célula hospedeira que desempenham funções essenciais para o parasito e esse exportoma pode conter alvos moleculares para o desenho de novas drogas e de vacinas. Esse trabalho buscou testar estratégias inovadoras para o estudo do exportoma. A primeira estratégia otimizada foi o subfracionamento do exportoma por lise seletiva com estreptolisina O (toxina que lisa seletivamente a membrana do eritrócito) seguida de centrifugação. Na fração enriquecida de conteúdo membranar e periférico, foram identificadas proteínas conhecidas do exportoma e não se observou a presença de proteínas da membrana do vacúolo parasitóforo, o que reforça e especificidade da lise. As análises de ontologia genética demonstraram um enriquecimento de proteínas exportadas e de membrana nessa fração. Também foram identificadas muitas proteínas envolvidas com a síntese proteica, associadas ao DNA, relacionadas ao metabolismo, do citoesqueleto e chaperonas. A identificação da PfPDI-8, proteína descrita como uma chaperona que preserva as estruturas moleculares corretas de outras proteínas, na fração membranar da hemácia suscitou que ela provavelmente auxilia as proteínas recém-exportadas. Assim a presença da PfPDI-8 foi validada por western blotting e suas parceiras foram estudadas por BN-BLOT (BN-PAGE acoplado a western blotting). Observou-se que, a partir de um extrato de parasitos, a PfPDI-8 foi identificada na mesma banda que uma proteína também conhecida do retículo endoplasmático, a BIP. A segunda técnica inovadora testada foi a biotinilação de proteínas pela peroxidase de ascorbato 2 (APEX2). As condições de expressão e purificação da proteína recombinante foram definidas. As análises por western blotting demonstraram que apenas a condição que continha todos componentes da reação (APEX2, H2O2 e biotina fenol) demonstrou marcação pela estreptavidina-HRP. Esse resultado indica a possibilidade de utilização da marcação de proteínas de superfície pela APEX2, porém essa técnica ainda requer otimizações antes de ser utilizada para esse fim. As abordagens testadas nesse estudo contribuíram para um maior conhecimento do exportoma do P. falciparum.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Malaria is considered a very aggressive disease and Plasmodium falciparum is the specie responsible for the majority of deaths. The development of new drugs requires deep knowledge about parasite biology and about its essential proteins and how they interact with each other. P. falciparum exports proteins into host cell and these exported ones could be targets for drug design. In this work, we investigated new and complementary techniques to studying P. falciparum exportome. The first one was the fractionation of exportome by Streptolysin O selective lysis followed by strong centrifugation. Some well-known exported proteins were identified in membrane enriched fraction and components of parasitophorous vacuole membrane was not identified, it indicates specificity of Streptolysin O lysis. Gene ontology analysis demonstrated that exported and membrane proteins was enriched in membrane fraction. Some proteins involved in protein synthesis, metabolism reactions, chaperoning and cytoskeleton structure were also identified. PfPDI-8 was identified in the membrane fraction and, as a chaperone, probably refold exported proteins inside the host cell. The presence of PfPDI-8 in the fractions was confirmed by western blotting and its protein partners was studied by native blotting. It was observed that PfPDI8 colocalized in the same band with endoplasmic reticulum resident protein BIP. The second new approach was biotinilation of surface proteins by ascorbate peroxidase 2 recombinant. Expression and purification conditions for APEX2 recombinant were defined. Activity assay demonstrated that APEX2 biotinylated other proteins. Further optimization is necessary to using APEX2 to labelling surface proteins of P. falciparum infected red blood cells. This work contributed to increase our knowledge of P. falciparum exportome