ANALISI DELL'ANDAMENTO TRASCRIZIONALE DEI GENI CLOCK PER LA VALUTAZIONE DELLA QUALITÀ DEL SONNO.

Il sonno è uno stato fisiologico indispensabile per il corretto funzionamento dei processi metabolici, energetici e immunologici dell’organismo che si alterna ciclicamente con lo stato di veglia dando origine al Ritmo Circadiano (dal latino circa diem: “intorno al dì”). Il ciclo sonno-veglia viene regolato tramite meccanismi endogeni influenzati da stimoli esterni (detti Zeitgeber) quali la luce, i pasti, la temperatura corporea e l’esercizio fisico. La sede principale dell’orologio biologico, che regola i cicli sonno-veglia, è stata individuata nei Nuclei Soprachiasmatici, ossia le regioni neuronali nella parte anteriore dell’ipotalamo, che sono direttamente collegati alla retina attraverso connessioni sinaptiche. Essi infatti ricevono ed elaborano gli stimoli visivi collegati alla luce e inviano segnali alla restante parte del Sistema nervoso Centrale e dell’organismo. La comunicazione tra orologio principale e le cellule dei distretti periferici avviene sia tramite la produzione di ormoni, come Melatonina e Cortisolo, sia attraverso la trascrizione ciclica dei geni Clock, che agiscono da fattori di trascrizione di altri geni necessari al corretto funzionamento dell’intero orologio biologico dell’organismo. L’architettura trascrizionale che regola i ritmi circadiani è costituita da meccanismi ciclici a feedback negativo, i cui protagonisti principali sono i geni Clock, Bmal1, Per (1/2) e Cry (1/2). Clock e Bmal1 sono geni che codificano per proteine che promuovono la trascrizione, mentre Per (1/2) e Cry (1/2) codificano per proteine che funzionano da repressori. Di questi quattro geni sono state osservate oscillazioni circadiane nei loro livelli di espressione, sia nell’orologio biologico principale, sia in altri distretti del nostro organismo. L’approfondimento di queste vie trascrizionali ha evidenziato come una disfunzione di questo complesso meccanismo possa portare a uno squilibrio di varie funzioni fisiologiche e probabilmente a connesse patologie. Tuttavia, la correlazione tra qualità del sonno e ciclo sonno-veglia nell’uomo risulta molto complicata, in quanto resa difficile dal fatto che i dispositivi utilizzati per monitorare vari parametri, possono incidere sulla qualità del sonno stesso e rendere difficile l’ottenimento di dati scientifici accurati. Per questo si è sempre più diffuso l’utilizzo di dispositivi indossabili, come orologi da polso, per cercare di ovviare al problema ed ottenere dati sempre più accurati sulla qualità del sonno del soggetto. Lo scopo di questa tesi è stato quello di analizzare le oscillazioni circadiane dell’espressione genica dei geni Clock in 21 soggetti sani di sesso maschile e con età compresa tra i 18 e i 40 anni, reclutati tra gli studenti dell’Università di Pisa. I soggetti hanno aderito allo studio su base volontaria, dopo essere stati informati sulle modalità di svolgimento e dopo aver firmato il consenso informato (sottoposto a precedente verifica e validazione del Comitato Etico dell’Università di Pisa). A ciascun soggetto sono stati proposti cinque questionari: Morningess-Eveningess Questionnaire (MEQ), per la valutazione dei ritmi circadiani; Pittsburgh Sleep Quality Index (PSQI) per la valutazione dei disturbi del sonno; State-Trait Anxiety Inventory (STAI) per la valutazione dell’ansia di stato e di tratto; Daily stress inventory, per valutare lo stress giornaliero delle persone; BisBas, per valutare i tratti biologici della personalità. I soggetti hanno poi indossato costantemente per 24 h tre dispositivi: due orologi da polso e una fascia toracica con funzione di actigrafo collegata a uno dei dispositivi da polso. I partecipanti allo studio hanno dovuto compilare nell’arco delle 24 ore un diario orario delle proprie attività (pasti, attività motoria etc.…) e, utilizzando dei kit forniti al momento della firma del consenso, prelevare la propria saliva in tre momenti della giornata: appena usciti dalla stanza, la sera prima di dormire, al risveglio. Nell’eventualità di risvegli notturni i partecipanti hanno fornito un ulteriore prelievo di saliva. I soggetti hanno inoltre riportato l’EMA (Ecological Momentary Assessment Emotion Tool) e compilato il questionario PANAS (Italian Positive and Negative Affect Schedule) per 5 volte durante le 24 ore di registrazione dei dati. I questionari sono stati compilati a vari orari: alle ore 10, 14, 18, 22 e 9 della mattina seguente. I prelievi di saliva, eccezion fatta di quello fornito subito dopo essere usciti dalla stanza, sono stati utilizzati per l’analisi dell’andamento trascrizionale dei geni Bmal1 e Per1, tramite estrazione di mRNA da saliva e utilizzando metodiche di amplificazione genica. I risultati ottenuti sono stati poi utilizzati per verificare l’esistenza o meno di una correlazione con i dati dei questionari e dei dispositivi indossabili. Questo lavoro di tesi può rappresentare un interessante punto di partenza per lo sviluppo di metodiche analitiche finalizzate alla valutazione oggettiva della qualità del sonno di un individuo, con la possibilità un giorno di poterle utilizzare come biomarcatori di prodromi di varie patologie legate a disfunzioni del ritmo circadiano