Prevención de la aparición de defectos asociados a Brettanomyces/Dekkera aplicando modelado de variables predisponentes en vinos tintos

Tesis para obtener el grado de Doctora en Ciencias Biológicas, presentada en la Facultad de Ciencias Exactas Físico-Químicas y Naturales, Universidad Nacional de Río Cuarto en septiembre 2015La alteración del vino por levaduras contaminantes representa un serio problema para la industria causando importantes pérdidas económicas. Dekkera spp ha sido descripta como la principal levadura contaminante de vinos tintos y está asociada con la detección de fenoles volátiles que le confieren al vino características organolépticas negativas asociadas con aroma animal, sudor de caballo, cuero o establo. Estos aromas provienen del metabolismo de los ácidos hidroxicinámicos (ácido p-cumárico y ferúlico) presentes en la uva, los cuales son decarboxilados a vinilfenoles y luego reducidos a etilfenoles. Estos últimos son compuestos muy volátiles y presentan un bajo umbral de percepción. La relación que existe entre el crecimiento de la levadura y la síntesis de fenoles volátiles en vinos es motivo de controversia. Una vez que el vino desarrolla el defecto, no es posible de eliminar sin reducir la calidad global del mismo. La forma más eficaz para controlar la aparición de defectos asociados a D. bruxellensis es previniendo su formación. Los modelos probabilísticos permiten obtener las interfaces de crecimiento/no crecimiento de microorganismos alteradores en función de los factores ambientales, representando una herramienta útil para prevenir el crecimiento de Dekkera en vinos. En el presente trabajo se identificaron las levaduras productoras de defecto en vinos tintos de Argentina y se demostró que D. bruxellensis era la única especie encontrada. Se diseñó un medio de cultivo simil-vino químicamente definido que permitió la obtención de resultados reproducibles en condiciones controladas, los cuales fueron luego exitosamente extrapolados a los vinos. Se caracterizaron las actividades cumarato decarboxilasa y vinilfenol reductasa de 5 cepas nativas de D. bruxellensis y se correlacionaron con la formación de fenoles volátiles, concluyendo que estas actividades no son indicadoras de la capacidad de la cepa para producir fenoles volátiles en condiciones simil-vino. Se evaluaron diferentes concentraciones de ácidos hidroxicinámicos precursores y se observó que una mayor concentración de ácidos hidroxicinámicos permite una mayor síntesis de fenoles volátiles por D. bruxellensis en condiciones simil-vino, independientemente de la cepa involucrada. Por otro lado, se caracterizó el crecimiento de la levadura y se determinó el momento en el cual se sintetizan los fenoles volátiles en condiciones simil-vino. La curva de crecimiento para las diferentes cepas mostró dos ciclos de desarrollo. En el primer ciclo de crecimiento se observó la completa transformación de los precursores a fenoles volátiles y, coincidentemente la mayor producción de etilfenoles. Paralelamente, se evidenció el consumo de todos los azúcares en esta etapa. Nuestro trabajo demostró que la síntesis de fenoles volátiles se produce durante el crecimiento activo de D. bruxellensis en condiciones simil-vino. Este resultado brindó las bases para desarrollar un modelo predictivo para D. bruxellensis en vinos, ya que inhibiendo su crecimiento se inhibe consecuentemente la formación de fenoles volátiles. Se determinó el límite de crecimiento/no crecimiento de D. bruxellensis en función del pH, SO2 libre y etanol. Los niveles de las variables en estudio aplicadas de un modo combinado fueron: etanol (10-15 %, v/v), pH (3,4-4,0), SO2 libre (0-50 mg/L) y tiempo (7, 14, 21 y 30 días). El análisis de los datos se realizó mediante un modelo logístico/probabilístico utilizando al tiempo como variable dummy, generando gráficos de superficie de respuesta. El modelo obtenido fue validado exitosamente en vinos. El modelo tiene una aplicación directa para la industria determinando las condiciones necesarias para inhibir el crecimiento de esta levadura en función de variables que pueden ser ajustadas durante la elaboración de un vino y permite determinar otras combinaciones de las variables limitantes en función de las necesidades de la industria.Wine spoilage is a serious problem for the wine industry because it renders the product unacceptable and can lead to huge economic losses. Dekkera species has long been recognized as a common contaminant in wine. Wine spoilage by D. bruxellensis has been associated with production of volatile acidity and phenolic off-flavours described as horse sweat, band aid, barnyard and burnt plastic. The formation of these volatile phenols has been shown to be the result of the enzymatic transformation of phenolic (hydroxycinnamic) acids naturally present in grape and wine into vinylphenol derivatives through the action of a coumarate decarboxylase activity and then reduced to an ethyl derivative through a vinylphenol reductase enzyme. These volatile phenols, especially the ethylphenols, have a low sensorial threshold. The overall information about the growth of D. bruxellensis and phenols production appears to be sometimes contradictory. Once the wine develops the defect, it is not possible to remove it without reducing the overall quality. The most efficient way to prevent wine spoilage by D. bruxellensis is to control its development and ethylphenol production through winemaking management using a preventive approach. Probabilistic models have been widely used in predictive microbiology to obtain the growth/no growth interfaces of spoilage and pathogen microorganisms as a function of environmental factors and cold be a good approach to prevent Dekkera growth in wines. During the present work we have demonstrated that D. bruxellensis was the only species present in spoiled red wines from Argentina. A chemically-defined ‘wine-like’ medium was design which allowed us to obtain reproducible results in controlled conditions that can be extrapolated, in this particular case, to yeast behavior in wine. The coumarate decarboxylase (CD) and vinylphenol reductase (VR) enzyme activities in 5 native D. bruxellensis strains was determined and also their relation with the production of ethylphenols under ‘wine-like’ conditions. We concluded that potential spoilage of wine by D. bruxellensis was more related to the ability of the strains to develop in the wine environment than the CD and VR enzymatic activity recorded in laboratory conditions. Different concentrations of hydroxycinnamic acid precursors were evaluated and we observed that at high concentration of hydroxycinnamic acids allow a high volatile phenol synthesis by D. bruxellensis in ‘wine-like’ conditions, regardless of the strain evaluated. On the other hand, the growth of yeast was characterized in order to determine the moment when volatile phenol were synthesized in ‘wine-like’ conditions. Growth of D. bruxellensis under ‘wine-like’ conditions showed two growth phases. Sugars were completely consumed during the first growth phase. Transformation of HCAs into ethylphenols also occurred during active growth of the yeast. According to this result, inhibition of growth of D. bruxellensis in wine seems to be the most efficient way to avoid ethylphenol production and the consequent loss of wine quality. We used a probabilistic model to determine the growth/no growth interfaces of the spoilage wine yeast D. bruxellensis as a function of ethanol (10–15 %, v/v), pH (3.4–4.0) and free SO2 (0–50 mg/l) using time (7, 14, 21 and 30 days) as a dummy variable. Data analysis was performed using a logistic/probabilistic model using time as dummy variable, generating response surface graphics. The model obtained was successfully validated in wines. The model gives us a first indication of the growth probability of this spoilage yeast under wine conditions and could be a valuable tool for the wineries because it allows, as a function of the needs of the industry, estimating diverse combinations of the environmental variables which inhibit the growth of this species.EEA MendozaFil: Sturm, Maria Elena. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Mendoza; Argentin