Determining the Proteome Binding to Stress-Induced tRNA Fragments

Transfer RNAs (tRNAs) sind kleine nicht-kodierende RNAs mit der höchst konservierten Funktion als Adaptormoleküle während der Proteinbiosynthese. Neben dieser kanonischen Funktion sind tRNAs auch Ausgangsmoleküle für tRNA-derived small RNAs (tsRNAs), einer neuen klasse kleiner RNAs. Neben Entwicklungs-tsRNAs, die durch Spaltung des D- oder T-loops der parentalen tRNA mittels Dicer entstehen, wurde die Produktion von tRNA-Hälften oder stress-induzierten tRFs während des Einflusses durch umgebungsbedingt Stressoren beobachtet. Bei akutem Stress werden tRNAs durch Angiogenin (ANG) im Anticodonloop endonukleolytisch gespalten. Diese 30-35 Nukleotide langen tsRNAs wurden mit biologischen Prozessen wie translationale Inhibierung, interzellulärer Signaltransduktion und transgenerationeller Vererbung von erworbenen Eigenschaften in Verbindung gebracht. Weiters wurden stress-induzierte tsRNAs in diversen Krankheitsstadien wie viralen Infektionen, Tumoren und neurodegenerativen Krankheiten nachgewiesen. Jedoch ist die exakte biologische Funktion von stress-induzierten tsRNAs, zum Beispiel ob sie diese Funktionen alleine oder in Assoziation mit Proteinen ausüben, noch unklar. Da tRNAs modifiziert sind, ist dies wahrscheinlich auch für tsRNAs der Fall. In dieser Thesis wurde eine Methode entwickelt um spezifische und modifizierte stress-induzierte tsRNAs zu isolieren und mit Biotin zu markieren. Diese isolierten tsRNAs wurden für RNA Affinitätschromatography mit verschieden Proteinextrakten verwendet. Interaktom Analysen wurden ausgeführt und der Einfluss der RNA Modifikationen auf Proteinbindung wurde untersucht. Dies zeigte einen Einfluss von posttranskriptionellen Modifikationen auf die Interaktionen zwischen tsRNA und Proteinen auf. Diese Resultate unterstützt die Annahme, dass diese Methode einen effizienten Ansatz zur Identifikation von Proteinen, die an kleine RNAs mit verschiedenen Modifikationsmustern binden, darstellt.Transfer RNAs (tRNAs) are small non-coding RNAs with a highly conserved function as adaptor molecules in protein biosynthesis. Apart from this canonical function, tRNAs give rise to tRNA-derived small RNAs (tsRNAs), a new class of small RNAs. Besides developmental tsRNAs derived from the D- or T-loop of parental tRNA, production of tRNA halves or stress-induced tsRNAs was observed in cells exposed to environmental stressors. Upon stress exposure, tRNAs are endo-nucleolytically cleaved by Angiogenin (ANG) in the anticodon loop. These 30-35 nucleotide-long stress-induced tsRNAs have been implicated in various biological processes such as protein translation, intercellular signaling and transgenerational inheritance of acquired traits. Furthermore, stress-induced tsRNAs were observed in multiple disease states such as viral infections, cancer or neurodegenerative illnesses. Still, the exact biological function of stress-induced tsRNAs, for instance whether they function alone or through interactions with proteins remains unknown. Since tRNAs are chemically modified, stress-induced tsRNAs are likely modified, too. In this thesis, a method was developed allowing to purify and biotin-tag specific and modified stress-induced tsRNAs. These purified tsRNAs were used for RNA affinity chromatography using different protein extracts. Interactome analysis was performed, and the influence of RNA modifications on protein binding was investigated. This revealed an impact of post-transcriptional modifications on tsRNA-protein interactions supporting the notion that this method represents an efficient approach for the identification of protein binders to small RNAs with various RNA modification patterns.Wien, FH Campus Wien, Masterarb., 2019(VLID)359893