Avaliação do potencial imunoestimulador de polissacarídeos da levedura

Mestrado em Bioquímica - Bioquímica ClínicaNa indústria das bebidas fermentadas, nomeadamente da cerveja, são usadas leveduras do género Saccharomyces, que são descartadas após alguns ciclos de fermentação. A parede celular das leveduras é composta por manoproteínas, glucanas (β13) e (β16), glicogénio e quitina, sendo que recentemente também foi descrita a presença de glucanas (β14), polímeros semelhantes à celulose. As manoproteínas e as glucanas (β13) são descritas por apresentarem propriedades imunoestimuladoras e antitumorais, sendo reconhecidas por recetores específicos que induzem respostas inflamatórias, sendo classificadas como Biological Response Modifiers. Atendendo à quantidade elevada deste subproduto da indústria cervejeira, o objetivo desta dissertação foi desenvolver metodologias de extração utilizando micro-ondas que permitissem obter glucanas e manoproteínas com possível atividade imunoestimuladora. Neste trabalho foi feita a extração de polissacarídeos da parede celular da levedura cervejeira, após autólise, recorrendo a extração aquosa sequencial assistida por micro-ondas. O potencial efeito imunoestimulador dos polissacarídeos extraídos foi estudado in vitro utilizando esplenócitos de murganhos. Foram efetuados quatro ciclos extrativos à mesma levedura excedentária, os dois primeiros a 180ºC, a que se seguiram dois ciclos a 200ºC, sempre utilizando uma razão sólido/água de 1:28 (m/m). Verificou-se que a primeira extração permite obter um extrato rico em manose (75% do total de carbo-hidratos no extrato), na segunda extração o extrato tinha quantidades equimolares de manose e glucose e no terceiro e quarto extratos a glucose representa 80 e 70%, respetivamente do total de carbo-hidratos presentes em cada extrato. A manose presente nos extratos encontrava-se maioritariamente em ligações (12) e (12,6), características das manoproteinas da levedura. A identificação de resíduos de glucose em ligação (14) e (14,6) permite inferir a presença de glicogénio das paredes celulares da levedura. No quarto ciclo foram identificados 32% de resíduos de glucose em ligação (13) juntamente com 34% de resíduos de glucose em ligação (14). Para identificar a configuração anomérica dos resíduos de glucose em ligação (14), foi efetuada uma hidrólise enzimática com α-amilase e celulase ao material proveniente da quarta extração com micro-ondas. O tratamento com α-amilase permitiu verificar a diminuição de massa do extrato após diálise e o enriquecimento em resíduos (13)-Glc, confirmando a presença de glicogénio. O tratamento com celulase permitiu verificar a perda de massa após diálise e a diminuição da percentagem de ligações (14), o que confirma a presença de glucose em ligaçao (β14). No entanto, não se verificou um enriquecimento em (13)-Glc, o que poderá indicar a presença no mesmo polissacarídeo de ligações (13) e (14) que, após tratamento com celulase, difundiram pela membrana de diálise. Estes ensaios permitiram também estimar que a conformação da glucose em ligação (14) é maioritariamente α. O primeiro e quarto extratos foram submetidos a um fracionamento por cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S200, tendo-se recolhido 3 frações de cada extrato com diferentes massas moleculares e composição em ligações glicosídicas. Estas frações, juntamente com os quatro extratos obtidos inicialmente e o 4º extrato obtido após hidrólise com α-amilase foram estudados quanto ao seu potencial imunoestimulador de linfócitos B e T. As amostras ricas em manoproteínas, nomeadamente as 3 frações obtidas por cromatografia de exclusão molecular do 1º extrato ativaram os linfócitos B, com um máximo de ativação celular de 61% para 25 e 50 μg/mL com a primeira e terceira frações, respetivamente, e com 40% para a segunda fração (25-75 μg/mL). Este trabalho permitiu concluir que é possível extrair com micro-ondas manoproteínas da levedura excedentária de cerveja com potencial atividade imunoestimuladora.The genus Saccharomyces are the yeast used in breweries, which are discarded after a few cycles of fermentation. Yeast cell wall is composed of mannoprotein, glucan (β13), (β16), glycogen, and chitin. Recently, it was described the presence of (β14) linked glucose linkages, resembling these polymers cellulose. Mannoproteins and glucans (β13) are described as having immunostimulatory and antitumor properties and are recognized by specific receptors that induce inflammatory responses, are classified as Biological Response Modifiers. Atending to the high quantities of this byproduct from brewery industry, the aim of this dissertation was to develop microwave extraction methodologies that would alow to obtain glucans and mannoproteins with potential immunostimulatory activity. In this work, the extraction of cell wall polysaccharides from brewers spent yeast was performed using microwave assisted aqueous sequential extraction. The extracted polysaccharides potencial immunostimulatory activity was studied in vitro using BALB/c mice splenocites. Four extraction cycles were performed to the brewers spent yeast, the first two at 180ºC, followed by two cycles at 200ºC using a solid/water ratio of 1:28 (w/w). In the first extraction a mannose rich extract was obtained, having 75% of the total carbohydrates. In the second extraction, an equimolar amount of mannose and glucose was obtained, and in the third and fourth extracts, glucose represented 80 and 70%, respectively, of the total carbohydrates of each extract. Mannose present in the extracts occurred mainly as (12)-Man and (12,6)-Man, which are characteristic of yeast cell walls. The presence of (14) and (14,6) linked glucose residues allowed to infer the presence of glycogen. The fourth cycle was composed of 32% of (13)-Glc and 34 % of (14)-Glc residues. To identify the anomeric conformation of the (14)-Glc residues, an enzymatic hydrolysis was done with α-amylase and cellulase to the material from the last extraction cycle. The treatment with α-amylase allowed to observe a mass decrease of the extract after dialysis and an enrichment in (13)-Glc residues, confirming the presence of glycogen. Cellulase treatment allowed to observe a mass decrease of the extract after dialysis and also a decrease of (14)-Glc linkages, confirming the presence of glucose in (β14) linkages. However, it was not observed an enrichment in (13)-Glc, which may indicate the presence of (13) and (14) linkages in the same polysaccharide, which should have diffused throughout the dialysis membrane after cellulase treatment. These trials allowed to estimate that the (14)-Glc linkages were mainly in α anomeric conformation. The first and fourth extracts were subjected to a fractionation by size exclusion chromatography using Sephacryl S200. Three fractions of each extract were collected, having diferent molecular weight and glycosidic linkage composition. These fractions, together with the 4 extracts obtained by microwave-assisted extraction, and the 4th extract hydrolised with α-amylase, were studied concerning their immunostimulatory potential activity towards lymphocytes B and T. It was observed that the samples rich in mannoproteins, namely the three fractions obtained from size exclusion chromatography from the first extract activated lymphocytes B. The maximum cellular activation was 61% for 25 and 50 μg/mL for the first and third fractions, respectively, and was 40% for the second fraction (25 e 75 μg/mL). This work allowed to conclude that using microwave assisted extraction it is possible to extract mannoproteins from brewers spent yeast with potencial immunostimulatory activity