In planta and in vitro studies of interactions between different Fusarium species and the infection of Fusarium langsethiae in oats

Abstract The genus Fusarium includes a diverse range of ascomycete fungi. Some species are known to cause Fusarium head blight (FHB) and other diseases on small grain cereals like oat, wheat and barley all over the world. Species of Fusarium are not only plant pathogens, but also mycotoxin producing agents, and this makes Fusarium species relevant to human and animal health. During infection, pathogens interact with each other as well as with the plant, and the object of this study was to gain more knowledge of these processes. The interactions between F. avenaceum, F. langsethiae, F. culmorum and F. graminearum during early infection of oats (6, 10, and 14 days post inoculation) were investigated. Oat panicles were spray inoculated with fungal inoculums and the amounts of Fusarium DNA was quantified by real-time quantitative PCR. The trends showed that F. avenaceum was not affected by F. graminearum, positively affected by F. culmorum and somewhat negatively affected by F. langsethiae when co-inoculated on the plant. F. langsethiae was in general negatively affected in all combinations. Interactions between F. langsethiae expressing green fluorescence protein (Fl-GFP) and the other Fusarium species were investigated in vitro during the first 26 hours of interactions in a co-inoculation experiment using confocal laser scanning microscopy (CLSM). This enabled us to differentiate F. langsethiae from the other species. The trends in this study indicated greater total hyphal length (spore + germtube) of the species when co-inoculated pair wise compared to when grown alone. Invasive growth was also found to be delayed when the species were co-inoculated compared to when grown alone. A gene expression study using four different target genes in F. langsethiae during early infection of oat, demonstrated higher expression of the putative genes; Sod, Nps4 and Fl-est17042 during infection compared to expression in mycelia alone. Using histological characterization, it was shown that the fungus is able to enter the plant through natural openings such as stomata, but that it might be depended on a nutrient source outside itself for successful establishment on the plant. The interaction between F. langsethiae and oats was demonstrated in a detached leaf assay, where oat leaves were inoculated with droplets of fungal inoculums. It was shown that the plant produced O2- radicals as a response to the pathogen, and that F. langsethiae, in turn, produced high amounts of SOD during infection, possibly making it more resistant to the reactive oxygen species (ROS). F. langsethiae is a relatively newly identified specie and its infection process in oats and interactions with the plant are poorly understood. This study greatly advanced our understanding of this plant pathogen. Sammendrag Slekten Fusarium inkluderer en rekke ascomycete sopparter. Noen av disse er kjent for å forårsake aksfusariose og andre kornsykdommer på for eksempel havre, hvete og bygg over hele verden. Fusarium arter er ikke bare plantepatogener, men også mykotoksinprodusenter. Dette gjør Fusarium artene relevante i forhold til menneske- og dyrehelse. Under infeksjon oppstår både samspill mellom Fusarium artene og mellom patogenen og planten, og målet med dette studiet var å oppnå mer kunnskap om disse prosessene. Samspillet mellom F. avenaceum, F. langsethiae, F. culmorum og F. graminearum ble studert under tidlig infeksjon av havre (6, 10 og 14 dager etter inokulering). Havre ble sprayinokulert med soppinokulum, og mengde Fusarium DNA ble kvantifisert ved bruk av real-time kvantitativ PCR. Trendene viste at F. avenaceum ble lite påvirket av F. graminearum, positivt påvirket av F. culmorum og noe negativt påvirket av F. langsethiae når artene parvis ble inokulert på planten. F. langsethiae var generelt negativt påvirket i alle kombinasjonene. Samspillet mellom F. langsethiae, som uttrykker grønn fluorescerende protein (Fl-GFP) og de andre Fusarium artene ble studert i ett co-inokulerings eksperiment der konfokal laser skanning mikroskop ble brukt. Dette gjorde det mulig å skille F. langsethiae fra de andre artene. Trendene i dette studiet indikerte en større total hyfelengde (spore + germtube) når artene ble co-inoculert parvis sammenlignet med når de vokste alene. Det ble også vist at invasiv vekst var forsinket når artene var co-inokulert sammenlignet med når de vokste alene. En genekspresjonsstudie undersøkte fire gener hos F. langsethiae under tidlig infeksjon av havre, og demonstrerte at genene Sod, Nps4 og Fl-est17042 var høyere uttrykt under infeksjon av havre sammenlignet med uttrykket i mycel alene. Ved bruk av histologisk karakterisering, ble det vist at soppen hadde evnen til å vokse gjennom naturlige åpningene i planten (stomata), men at den mest sannsynlig er avhengig av en næringskilde på utsiden av seg selv for vellykket etablering på planten. Samspillet mellom F. langsethiae og havre ble demonstrert i et blad assay hvor havreblader ble inokulert med dråper av soppinokulum. Det ble vist at planten produserte O2- radikaler som en respons på patogenen, og videre at F. langsethiae hadde produsert høy mengde SOD under infeksjon, noe som muligens gjør soppen mer resistent mot reaktive oksygen forbindelser. F. langsethiae er relativt nylig identifisert og dens infeksjonsprosesser i havre og samspillet med planten er lite forstått. Dette studiet utvidet i stor grad vår forståelse om denne plantepatogenen