Effekten av Lipopolysakkarid (LPS) på cysteinproteaser i RAW 264,7-celler og THP-1 celler

Ekspresjon og aktivitet av legumain ble studert i RAW 264,7-celler (en makrofaglignende leukemisk cellelinje fra mus) og THP-1 celler (en human monocyttlignende akutt leukemisk cellelinje). LPS (endotoksin) er et lipopolysakkarid som er en bestanddel av de gramnegative bakterienes cellevegg. Den toksiske delen av LPS er lipid A, som kan stimulere celler i immunsystemet. For å studere hvordan RAW 264,7-celler og THP-1 celler påvirkes av LPS, er det interessant å se på innhold av proteolytiske enzymer (cysteinproteaser legumain og cathepsin B) i endosom/lysosom. Legumain og CB er vist å bidra til antigenpresentasjon av MHC klasse II-molekyler. Ved reseptorstimulering via mikroorganismer eller cytokiner, induseres makrofager til å uttrykke MHC-II slik at de blir antigenpresenterende celler (APC). RAW 264,7-celler og THP-1 celler ble inkubert med og uten LPS i 0-72 timer. Enzymaktivitet av legumain og CB ble målt i cellelysat ved hjelp av spesifikke peptidsubstrater og beregnet i forhold til total proteininnhold. Innhold og størrelse av legumain i RAW 264,7-celler og THP-1 celler ble analysert ved immunodeteksjon (Western blot) med legumainspesifikt antistoff. Ved hjelp av Real Time-PCR analyse ble legumain m-RNA undersøkt i RAW 264,7-celler og THP-1 celler, og om legumain reguleres ved stimulering med LPS. Resultatene viste at legumain og CB enzymaktivitet er mye høyere i RAW 264,7-celler enn i THP-1 celler (for ustimulerte og stimulerte celler). Funnene tyder ikke på at LPS har noe virkning på legumain og CB enzymaktivitet, da det var ingen forskjell mellom ustimulerte og stimulerte celler. Innhold og størrelse av legumain i RAW 264,7-celler viste et proteinbånd på 37 kDa. Dette båndet kan representere en aktiv form av legumain, siden vi målte en økning i spesifikk enzymaktivitet ved samme behandling og tidspunkt. Men legumain i THP-1 celler viste et protein bånd på 50 kDa. Dette båndet kan representere en inaktiv form av legumain, siden vi så ikke bånd i området 32-37 kDa, der vi forventet å finne den aktive formen av legumain. Dette stemte med aktivitetsmålinger. Det er uklart om LPS har noe effekt på legumain m-RNA, og om man kan forvente at ekspresjon av legumain i kontroll av antigen prosessering vil bli redusert i en tilstand av endotoksintoleranse i monocytter