Mutagenese, ekspresjon og karakterisering av DNA polymerase I fra den varmestabile bakterien Thermotoga Maritima

Sammendrag Alle levende organismer inneholder en eller flere DNA polymeraser, og dette enzymet er helt nødvendig for videreføring av arvestoffet fra generasjon til generasjon. DNA- polymeraser har også etter hvert fått en uvurderlig rolle i flere bioteknologiske teknikker. En av disse teknikkene er DNA-sekvensering ved hjelp av kjedeterminering, det vil si ved inkorporering av dideoksynukleotider. Det er derfor interessant å forsøke å utvikle DNA polymeraser med forbedrete og tilpassede egenskaper til slike teknikker. I denne oppgaven ble det arbeidet med DNA polymerase I fra Thermotoga Maritima, Tma polymerase I. Thermotoga Maritima er en varmestabil bakterie noe som vil si at den vokser ved høyere temperaturer enn de fleste bakterier. Thermotoga Maritima har et temperaturoptimum ved 80 grader. Det å benytte en DNA polymerase fra denne bakterien er derfor en fordel i sekvensering ved kjedeterminering hvor DNA-fragmentene blir denaturert ved 95 grader i hver syklus. Hvis man da benytter varme-stabile DNA polymeraser trenger man ikke å tilsette nytt enzym for hver syklus. Det finnes allerede flere varmestabile DNA polymeraser som benyttes i sekvensering, blant annet DNA polymerase I fra Thermus Aquaticus (Taq) med mutasjonen F667Y. Denne varianten av Taq polymerase I har en forbedret evne til inkorporering av ddNTP, noe som gjør det til et bedre sekvenseringsenzym. I denne oppgaven ble denne mutasjonen innført i tilsvarende posisjon hos Tma polymerase I; Fenylalanin i posisjon 730 ble substituert med en tyrosin ved hjelp av setestyrt mutagenese. Dette skulle føre til nedsatt diskriminering mot inkorporering av ddNTP. Deretter ble både nativ og mutert Tma polymerase uttrykt i E.coli-celler og det ble laget lysat som inneholdt de aktive enzymene. Optimal ekspresjonstid, lineært område og antall enheter i lysatene ble bestemt ved hjelp av en fluorescensbasert aktivitetsanalyse. Deretter ble lysatene forsøkt renset uten særlig hell, så videre undersøkelser av enzymene ble gjort på grovlysatene. De to enzymene ble testet i sekvensering ved kjedetermineringsmetoden. Det ble da bevist at mutasjonen har den ønskede effekten, da den muterte varianten fungerte godt under betingelser som var tilpasset den muterte varianten av Taq (F667Y). Den native fungerte ikke under disse betingelsene, men krevde en veldig mye høyere konsentrasjon av dideoksynukleotider. Disse analysene ble gjort på Alfexpress; hvor det benyttes en fluorescensmerket primer for å detektere fragmentene. Det ble også på Alfexpress; gjort sammenligninger mellom nativ Taq polymerase og nativ Tma polymerase. Resultatene her tydet på at Tma er et dårligere sekvenseringsenzym enn Taq polymerase. De siste undersøkelsene som ble gjort var å benytte den muterte varianten av Tma polymerase med fluorescensmerkede dideoksynukleotider på MegaBACE-systemet. Dette ble gjort med tanke på å sammenligne Tma polymerase (F730Y) med polymerasen som benyttes i det kommersielle kitet. Da Tma polymerase ikke fungerte i dette systemet under betingelsene som ble forsøkt, var det ikke mulig å sammenligne de to polymerasene