Dei lysosomale cysteinproteasane legumain og cathepsin B i apoptose

Apoptose vert ofte sett på som caspase-avhengig celledød, men det er òg vist at apoptose kan vere avhengig av lekkasje av lysosomale cysteinproteasar til cytosol. Dette er vist for cathepsin B, men ikkje for den lysosomale cysteinproteasen legumain. Legumain liknar caspasane i både aminosyresekvens og struktur, noko som gjer det naturleg å tru at denne proteasen kan delta i apoptose ved lekkasje til cytosol. Målet med denne oppgåva var å studere legumain og (cathepsin B) i apoptose indusert av ulike dødsstimuli. PMA-stimulerte THP-1 celler vart dyrka i tre døgn før behandling med dødsstimuli i ulike tider. Det vart primært gjort forsøk med dødsstimulia Leu-Leu-OMe, staurosporin og PAC-1, med eller utan inhibitorane CA-074Me og Z-DEVD-cmk. Behandla celler vart studert i fluorescensmikroskop for å kartleggje morfologiske endringar. Cellekjernen vart studert etter farging med Hoechst 33342 og PI, og lysosoma vart studert etter farging med LysoTracker Red. Celleviabiliteten vart målt med MTS-assay og legumain-, cathepsin B- og caspase-3-aktivitet vart bestemt spektofotometrisk med spesifikke fluorescerande substrat. Behandling av THP-1 celler med Leu-Leu-OMe resulterte i permeable lysosommembranar, fullstendig undertrykking av legumain- og cathepsin B-aktivitet, og caspase-3-aktivering. Celledøden vart karakterisert som caspase-avhengig og legumain- og cathepsin B-uavhengig apoptose. Staurosporin induserte òg caspase-3-aktivering, men det vart ikkje observert permeable lysosommembranar eller endring i aktiviteten til verken legumain eller cathepsin B. Staurosporinindusert celledød var uavhengig av både caspase-3 og legumain/cathepsin B. I både Leu-Leu-OMe- og staurosporinindusert apoptose vart det likevel observert kraftigare aktivering av caspase-3 etter hemming av legumain og cathepsin B, noko som kan tyde på ein hemmande effekt av lysosomale proteasar på denne caspasen. Auka caspase-3-aktivitet og celledød vart òg observert etter behandling med PAC-1, men dødsprosessen kunne vanskeleg kategoriserast morfologisk som apoptose. PAC-1 induserte ein reduksjon i cathepsin B- (og legumain-) aktivitet sjølv om det ikkje vart registrert permeable lysosomer, men lite tyda likevel på at dødsprosessen var avhengig av desse lysosomale proteasane så vel som caspase-3. Leu-Leu-OMe, staurosporin og PAC-1 induserte celledød i THP-1 celler via truleg ulike mekanismar. Ei deltakande rolle for legumain (og cathepsin B) i dødsprosessane vart ikkje påvist, men det trengs fleire studiar for å kartleggje dette med sikkerheit