ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA RT-PCR TIEMPO REAL PARA LA DETECCIÓN DEL VIRUS DE LA NECROSIS PANCREÁTICA INFECCIOSA (VNPI) EN TRUCHAS ARCO IRIS (Oncorhynchus mykiss).

The objective of this study was to standardize and validate the real-time RT-PCR technique for diagnosis of Infectious Pancreatic Necrosis virus (IPNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) from Central Sierra of Peru. Samples of kidney and spleen (n=61) of rainbow trout with apparent clinical signs of IPN and from rainbow trout apparently healthy (n=60) were collected from two fish farms located in the central sierra. Before standardization of the real-time RT-PCR technique, the kidney and spleen samples of 121 rainbow trout were tested for antigen of IPNV by indirect immunofluorescent (IIF) test. In addition, kidney and spleen samples of 10 rainbow trout negative to IPNV by IIF were inoculated with a serial dilution of IPNV strain (from initial concentration of 103 PFU/ml). The RNA extraction of the 121 samples and of the 10 samples inoculated with IPNV strain, the cDNA and the real-time RT-PCR were carried out by commercial kits. The WB1 and WB2 primers were used to amplify a segment that codifies the protein VP2 of the Aquabirnavirus. A strain of IPNV as a positive control and Rotavirus A strain, Gumboro disease virus, bovine viral diarrhea virus, and parainfluenza-3 were used as negative controls. The 121 kidney and spleen samples were negative to IPNV by IIF test. The results of real time RT-PCR technique were evaluated considering the cycle threshold values of 31.7 and temperature melting of 80.4 °C of the amplicons. The real time RT-PCR technique was able to detect a concentration of 102 PFU/ml of IPNV in the kidney and spleen samples inoculated and the 121 of kidney and spleen samples were negative to IPNV. This technique had 100% of sensibility and specificity for detection of IPNV.El objetivo del presente estudio fue estandarizar y validar la técnica de RT-PCR tiempo real para el diagnóstico del virus de Necrosis Pancreática Infecciosa (VNPI) en truchas arco iris (Oncorhynchus mykiss) de la sierra central del Perú. Se colectaron muestras de riñón y bazo de truchas con aparentes signos clínicos de necrosis pancreática infecciosa (NPI) (n= 61) y truchas aparentemente sanas (n= 60) de dos piscigranjas del valle del Mantaro, Junín. Previo a la estandarización, las muestras fueron procesadas para la detección de antígeno del VNPI por inmunofluorescencia indirecta (IFI). Diez muestras de riñón y bazo de truchas negativas al VNPI por IFI fueron inoculados con una cepa del VNPI con título de 103 UFP/ml. La extracción del ácido nucleico del VNPI de las 121 muestras de riñón y bazo y de las 10 muestras de riñón y bazo inoculadas con el VNPI, la síntesis del ADN complementario y la RT-PCR tiempo real se realizaron utilizando kits comerciales. Se usaron los cebadores WB1 y WB2 correspondientes a un segmento del gen que codifica la proteína VP2 de los Aquabirnavirus. Una cepa del VNPI fue utilizada como control positivo y cepa de Rotavirus A, virus de Gumboro, virus de diarrea viral bovina, parainfluenza 3 como controles negativos. Las 121 muestras de riñón y bazo de las truchas arco iris resultaron negativas al VNPI por IFI. Los resultados de la RT-PCR en tiempo real fueron determinados en función a los valores del ciclo de amplificación que fue de 31.7 y temperatura de disociación de 80.4 °C de los productos del virus control positivo. La técnica de RT-PCR en tiempo real fue capaz de detectar hasta una concentración de 102 DI50UFP/ml del VNPI en las muestras de riñón y bazo inoculadas, mientras que las 121 muestras de truchas resultaron negativas al VNPI. La técnica de RT-PCR en tiempo real tuvo 100% de sensibilidad y especificidad en la detección del virus de la necrosis pancreática infecciosa en truchas arco iris