Características bioquímicas y acción biológica de una hemorragina del veneno de Bothrops brazili

Objective: To characterize a hemorrhagic protein from Bothrops brazili snake venom and to determine if the polyvalent antibotropic serum is able to neutralize it. Material and Methods: A hemorrhagic protein from Bothrops brazili snake venom was purified through two chromatographical steps: Sephadex G-100 and CM Sephadex C-50, respectively, using 0,05M ammonium acetate buffer pH 7. In the last chromatographical system the protein was eluted after 0,3M sodium chloride was applied; thus, a unique band was achieved by PAGE-SDS. A hemorrhagic action monitored through caseinolytic activity obtained 8,4 folds of purification and the minimum hemorrhagic dose (MHD) was 6,61 ug in albine mice. Results: A structural analysis of associated carbohydrates showed 8,05% of hexoses, 11,62% of hexosamines, and 0,69% of sialic acid; its termostability was detected at 50°C for 10 minutes while total inhibition was observed above this. This protein was very unstable at pH 5, 5mM; EDTA, glutamic acid and glutatión had potent inhibitor effects. In contrast, 10mM of Ca+2 increased the hemorrhagic area. Conclusions: Both inmunodiffusion and inmunoelectrophoresis essays showed that polyvalent botropic antivenom (NIH-Lima) recognized the hemorrhagic protein. Furthermore, in vivo experiments showed that the antivenom was capable to neutralize the whole venom but not purified haemorrhagine.Objetivo: Caracterizar la hemorragina aislada de B. brazili y determinar si el suero antibotrópico polivalente es capaz de neutralizarlo. Materila y métodos: Se ha purificado una hemorragina del veneno de Bothrops brazili a través de dos pasos cromatográficos en Sephadex G-100 y CM Sephadex C- 50, usando buffer acetato de amonio 0,05M pH 7. En este último sistema, la proteína fue eluida con NaCl 0,3M y el análisis electroforético en PAGE-SDS mostró una sola banda proteica. Usando caseína como substrato se determinó una purificación de 8,4 veces, habiéndose calculado la dosis hemorrágica mínima (DHM) en 6,61 ug usando ratones albinos. Resultados: El análisis de carbohidratos asociados a la hemorragina reveló un contenido de 8,05% de hexosas, 11,62% de hexosamina y 0,69% de ácido siálico, en tanto que su resistencia térmica fue registrada hasta 50°C por 10 minutos, ya que temperaturas mayores la inactivaron. La hemorragina fue muy inestable a pH 5,0 mientras que el tratamiento con EDTA, ácido glutámico y glutatión 5 mM también produjeron una severa inhibición, tanto en su acción hemorrágica como en su actividad caseinolítica. En cambio, por adición de iones calcio (10mM) se incrementó la intensidad del área hemorrágica. Conclusiones: Los ensayos de inmunodifusión e inmunoelectroforesis demostraron que el suero antibotrópico polivalente (Instituto Nacional de Salud [INS] - Lima) reconoció a la fracción hemorrágica y las pruebas de neutralización in vivo dieron como resultado la inhibición del veneno crudo, pero no de la hemorragina purificada