Reorganización del citoesqueleto regulada por STIM1 y ORAI1

Tesis doctoral con la Mención de "Doctor Internacional"En esta Tesis Doctoral se ha descrito el papel de STIM1 y ORAI1, los principales mediadores de la entrada extracelular de Ca2+ (SOCE), en la formación de las ondas y protrusiones de membrana plasmática, conocidas como ruffles, y la remodelación del citoesqueleto necesaria para la migración celular. Previamente al estudio del citoesqueleto hemos abordado el estudio de la interdependencia de ERK1/2, principal activador de STIM1, y SOCE para determinar si existe una contribución real de SOCE sobre la actividad de ERK1/2. Nuestros resultados confirmaron que la activación de ERK1/2 en respuesta a EGF es independiente al influjo de Ca2+ extracelular. En relación al estudio del citoesqueleto nuestros resultados muestran que STIM1 fosforilado se concentra en el frente de células en migración, y también que ORAI1 co-localiza con cortactina (CTTN), un regulador del citoesqueleto en regiones de ruffling de membrana. Mediante la utilización del sistema de edición genómica CRISPR/Cas9 en células U2OS se generaron las líneas celulares STIM1-KO y ORAI1-KO. En ambas líneas se observó una notable reducción de SOCE. Además, estas líneas KO presentan un menor número de ruffles de membrana y una dinámica de citoesqueleto débil y más lenta con respecto a las células U2OS wild-type. Todo ello permite concluir que STIM1 y ORAI1 son los principales mediadores del influjo de Ca2+ extracelular que permite el ruffling de membrana necesario para la migración celular. Además, nuestros datos revelaron que ORAI1 co-precipita con CTTN, y que esta interacción es dinámica y sensible al estado de llenado de depósitos intracelulares.In this Doctoral Thesis we have described the role of STIM1 and ORAI1, the two major components of SOCE, in the promotion of membrane ruffling required for the reorganization of the cortical cytoskeleton at the leading edge of migrating cells. Previously to the cytoskeletal study we described the interdependence of ERK1/2 and store operated calcium entry (SOCE). In this regard, our results revealed that the activation of ERK1/2 is STIM1- and SOCE-independent. Regarding to the study of the cytoskeleton, in the present work we described that phospho-STIM1 localizes at the leading-edge of cells, and that both phospho-STIM1 and ORAI1 co-localizes with cortactin (CTTN), a regulator of the cytoskeleton at membrane ruffling areas. STIM1-KO and ORAI1-KO cell lines were generated by CRISPR/Cas9 system in U2OS cells. In both cases, KO cells presented a notable reduction of SOCE, together with a striking decrease of the membrane ruffling, compared with U2OS wild-type cells. These results demonstrated that SOCE regulates membrane ruffling at the leading edge of cells. Moreover, we showed that ORA1 co-immunoprecipitated with CTTN. This latter result, in addition to the KO cells phenotype and the preservation of ORAI1-CTTN co-localization during ruffling, further support a functional link between SOCE and membrane ruffling.• Ministerio de Economía y Competitividad: Proyectos BFU2011-22798 y BFU-51402-P • Junta de Extremadura-Fondo Social Europeo: Proyecto GR15077 • Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España: Beca predoctoral de Formación del Personal Investigador (FPI) BES-2012-052061 • Federación Europea de Sociedades de Bioquímica: Beca de estancia en el extranjero FEBS Summer Felowship • Universidad de Extremadura: Ayuda puente para becarios predoctorales (Acción III) dentro del Plan de Iniciación a la Investigación