Estudo do papel biológico da proteína TCTP (Translationally Controlled Tumor Protein)

Orientadora: Profa. Dra. Andrea Senff RibeiroCoorientador: Prof. Dr. Silvio Sanches VeigaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 26/10/2018Inclui referências: p. 129-145Resumo: A TCTP (Translationally Controlled Tumor Protein) é uma proteína multifuncional expressa em diversos organismos e tecidos. Diferentes estudos já estabeleceram seu envolvimento na malignidade, reversão tumoral e apoptose. Além disso, em ambiente extracelular, ela atua como um fator de liberação de histamina (HRF). Esse trabalho é organizado em dois capítulos, o primeiro refere-se ao estudo da TCTP no processo de reversão tumoral em melanoma murino e humano. A atividade antitumoral da sertralina (droga que atua reduzindo os níveis proteicos da TCTP) foi avaliada e comparada à dacarbazina (quimioterápico de escolha no tratamento clínico do melanoma). Nossos resultados demonstram que a sertralina reduz os níveis proteicos da TCTP, além de aumentar os níveis intracelulares da P53 em células de melanoma. As células tratadas com sertralina reduziram a viabilidade celular, migração celular e a capacidade de gerar colônias em meio semi-sólido; mesmo após a remoção do tratamento o efeito foi mantido. Essas alterações sugerem uma complexa reprogramação celular desencadeada pela sertralina e acompanhada da redução da TCTP. Em ensaio in vivo, avaliando o uso da sertratina combinada ou não à dacarbazina, podemos observar que a sertralina é capaz de inibir a formação tumoral, sendo essa inibição superior a dacarbazina isolada. Além disso, o uso concomitante de sertalina e dacarbazina apresentou maior inibição do que os fármacos isolados. Analisando as biópsias dos tumores, observamos redução dos níveis da TCTP. Enquanto o tratamento com dacarbazina leva a um aumento da P53, com aumento da TCTP. Além disso, podemos observar uma redução da Ki67 e aumento da Caspase 3 nas biópsias dos animais tratados com sertralina. Esses resultados corroboram nossos dados anteriores e a literatura que relaciona altos níveis da TCTP com tumores agressivos, além de apontar a TCTP como uma proteína alvo para o estudo da reversão tumoral em linhagens de melanoma. No segundo capítulo deste trabalho descrevemos os estudos da caracterização da TCTP de aranha-marrom Loxosceles intermedia (LiTCTP) como fator de liberação de histamina. Nossos resultados mostram que a LiRecTCTP é capaz de degranular basófilos e assim gerar aumento da atividade ?- hexosaminidase. A LiRecTCTP gera um aumento do influxo de cálcio nas células concentração dependente e também aumenta a expressão de IL-3 e IL-4. Essa toxina foi capaz de aumentar a permeabilidade vascular e gerar edema de pata em camundongos. Quando os animais são tratados com antagonistas de receptores histaminérgicos e de degranulação de mastócitos podemos observar uma alteração na permeabilidade e na formação de edema. O cromoglicato (inibidor de degranulação) é capaz de inibir os efeitos de LiRecTCTP tanto in vivo quanto in vitro, porém a cimetidina, antagonista de receptos H2 (presente principalmente nas células da mucosa intestinal) não interfere significativamente nos efeitos da histamina liberada pela LiRecTCTP. Além disso, podemos observar que a LiTCTP está relacionada ao processo inflamatório decorrente do loxoscelismo, pois esta atuou aumentando o extravasamento de líquido intersticial e o edema e in vivo. Esses dados corroboram a literatura e confirmam que a LiTCTP libera histamina in vivo. Dessa forma podemos melhor compreender a TCTP na malignidade e tumorigênese do melanoma e como um fator de liberação de histamina. Palavras chaves: TCTP, reversão tumoral, melanoma, loxoscelismo, aranhamarrom, histamina.Abstract: Translationally Controlled Tumor Protein (TCTP) is a multifunctional protein expressed in various organisms and tissues. Different studies have already established TCTP involvement in malignancy, tumor reversion and apoptosis. In addition, in the extracellular environment, it acts as a histamine releasing factor (HRF). This work is organized in two chapters; the first refers to the study of TCTP in the process of tumor reversion in murine and human melanoma. The antitumor activity of sertraline (a drug that act by reducing protein levels of TCTP) has been evaluated and compared to dacarbazine (chemotherapy used in the clinical treatment of melanoma). Our results demonstrate that sertraline reduces protein levels of TCTP, in addition to increasing an intracellular levels of P53 in melanoma cells. Cells treated with sertraline reduced cell viability, cell migration and the ability to generate colonies in soft-agar, even after the treatment was removed for 5 days. These changes suggest a complex cellular reprogramming triggered by sertraline and accompanied by the reduction of TCTP. In the in vivo assay, the use of sertraline combined or not with dacarbazine was evaluated, we can observed that sertraline is able to inhibit tumor formation, this inhibition was stronger than the observed for dacarbazine alone. In addition, the concomitant use of sertraline and dacarbazine showed better results than the inhibition obtained by each drug alone. Analyzing the biopsies, we observed reduction of TCTP levels in tumors. While treatment with dacarbazine leads to an increase of P53, with increase of TCTP. In addition, we can observe a reduction of Ki67 and increase of caspase 3 in the biopsies of animals treated with sertraline. These results corroborate our previous data and the literature that relate high levels of TCTP with aggressive tumors, besides they point TCTP as a target protein for the study of tumor reversion in melanoma cell lines. At the second chapter of this work, we describe the characterization studies of the brown spider TCTP Loxosceles intermedia (LiTCTP) as a histamine releasing factor. Our results show that LiRecTCTP is able to degranulate basophils and thus generate increased ?-hexosaminidase activity. LiRecTCTP triggers an increase of calcium influx in the cells, in concentration-dependent manner and also increases the expression of IL-3 and IL-4. This toxin was able to increase vascular permeability and generate paw edema in mice. When animals are treated with histaminergic receptor antagonists and mast cell degranulation inhibitor, a change in permeability and formation of edema can be observed. Chromolyn (degranulation inhibitor) is able to inhibit the effects of LiRecTCTP in vivo and in vitro, but cimetidine, H2 receptor antagonist, (H2 is present mainly in intestinal mucosal cells) does not significantly interfere with the effects of LiRecTCTP. In addition, we show that LiTCTP is related to the inflammatory process in loxoscelism, LiRecTCTP increase the extravasation of interstitial fluid and promotes edema in vivo. These data corroborate the literature and the inhibition obtained by histamine antagonists confirm that LiTCTP triggers the release of histamine in vivo. In this way, our results provide meaninful information which helps to better understand the role of TCTP in melanoma malignancy and tumorigenesis and as a histamine releasing factor. Key words: TCTP, tumor reversion, melanoma, loxoscelism, brown spider, histamine