Gezielte Erzeugung und Analyse transgener Mäuse zur Aufklärung der Funktion der C-terminalen Domäne des Cx43 Proteins <i>in vivo</i>

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Expression der carboxyterminal verkürzten Cx43 Protein Isoform Cx43K258stop sowohl in HeLa-Zellen als auch in der transgenen Mauslinie Cx43K258stop erreicht. Mit Hilfe der HeLa Transfektanten wurde festgestellt, dass Cx43K258stop Protein eine verlängerte Halbwertszeit besitzt und größere Gap Junction Plaques ausbildet. Zudem wiesen aus Cx43K258stop Protein aufgebaute Connexone qualitativ dieselben homo- und heterotypischen Kopplungseigenschaften auf wie aus Cx43 Protein aufgebaute Halbkanäle. Mittels des hergestellten Zielgenvektors Cx43K258stop konnte der Austausch der cx43 kodierenden Region gegen die gewählte Mutation durch die Methode des genetischen Doppelersatzes erfolgreich in HM1 embryonalen Stammzellen der Maus erreicht werden. Nach Blastozysteninjektion homolog rekombinierter ES-Zellklone wurde mit Hilfe von chimären Mäusen, welche die Cx43K258stop Mutation über ihre Keimbahn an ihre Nachkommen vererbten, die transgene Mauslinie Cx43K258stop etabliert. Mehr als 97% dieser homozygot mutierter Mäuse starben auf Grund eines Defektes der epidermalen Permeabilitätsbarriere innerhalb der ersten 5 Tage nach der Geburt. Molekular wurde dieser Defekt der terminalen Kerationzyten-Differentiation von einer stark veränderten Expression des verkürzten Cx43 Proteins sowie einer veränderten Prozessierung und Lokalization des Filaggrin Proteins begleitet. Die wenigen überlebenden Cx43K258stop Tiere zeigten eine Kompensation des epidermalen Phänotyps begleitet von einer gegenüber Wildtyp Tieren unveränderten Filaggrin Expression. Da Tiere mit einem cx43K258stop und einem vollständig deletierten cx43 Allel den epidermalen Phänotyp nicht zeigten, konnte der Barriere Defekt direkt mit der exprimierten Cx43K258stop Proteinmenge korreliert werden. Im Gegensatz zu Mäusen mit genereller Cx43 Defizienz, zeigten neonatale Cx43K258stop Mäuse keine Blockade des rechten ventrikulären Ausflusstraktes des Herzens. Dennoch prägten neonatale und einige der überlebenden homozygot mutierten Tiere eine signifikante Herzanomalie in Form eines stark kugeligen Herzens aus. Echokardiographie adulter Tiere wies auf eine eingeschränkte Funktionalität des linken Ventrikels hin. Elektrokardiographien neonataler Tiere deckten Repolarisationsstörungen des Ventrikels in 20% aller homozygot mutierten Tiere auf. Molekular zeigte sich eine erhöhte epikardiale Expression des Cx43K258stop Proteins. Die beobachteten morphologischen Veränderungen beruhen vermutlich auf einem Einfluss der Cx43K258stop Mutation sowohl auf die Elektrophysiologie als auch auf die Architektur des Zytoskeletts der Kardiomyozyten. Überlebende homozygot mutierte Weibchen waren auf Grund einer gestörten Folikelreifung und Ovulation unfruchtbar. Die Ergebnisse untermauern die essentielle Bedeutung der regulativen carboxyterminalen Domäne für aus Cx43 Protein aufgebaute Gap Junction Kanäle in vivo.Investigation of the function of the Cx43 protein C-terminal domain in vivo by generation and analysis of transgenic mice In the present work the expression of the carboxyterminally truncated Cx43 protein isoform Cx43K258stop was established in both HeLa-cells and in the transgenic mouse model Cx43K258stop. Analysis of the Cx43K258stop HeLa transfectants revealed a prolongation in half-life and an increase of Gap Junction plaque size. Connexons formed by Cx43K258stop protein displayed the identical homo-and heterotypical coupling properties as Cx43 connexons. By means of the gene targeting vector Cx43K258stop the replacement of the cx43 coding region with the chosen mutation was achieved. This was done with the methode of gene double replacement in embryonic HM1 stem cells of the mouse. Via blastocyste injection of homolgously recombined ES cell clones chimeric mice were generated which gave rise to the transgenic mouse line Cx43K258stop. More than 97% of these homozygous mice died within 5 days of birth due to a defective epidermal permeability barrier. This defect in terminal kerationcyte differentiation was accompanied by a change in Cx43K258stop protein expression when compared to Cx43 protein in wild type mice. Additionally, the expression and complete processing of profilaggrin was disturbed. The small subset of surviving Cx43K258stop animals showed compensation of the epidermal phenotype. As animals with one cx43K258stop and one ablated cx43 allele did not display the epidermal phenotype, the barrier defect could be directly linked to the amount of Cx43K258stop protein expressed. In contrast to mice with general deletion of cx43, neonatal Cx43K258stop mice did not show an obstruction of the right ventricular outflow tract of the heart. Nevertheless, neonatal and surviving adult Cx43K258stop mice displayed a significant cardiac abnormality in the form of a bulb-shaped heart. Echocardiograms of adult mice pointed to an impaired function of the left ventricle. ECG analysis of neonatal animals revealed disturbance of repolarization in twenty percent of all homozygous Cx43K258stop mice. Cx43K258stop protein was elevatedly expressed in the epicardial region of the ventricle. The observed morphological changes are most likely due to the influence of the Cx43K258stop mutation on both the electrophysiology and the architecture of the cytoskeleton of cardiomyocytes. Surviving homozygous mutant females were infertile due to a disturbance of folliculogenesis and ovulation. These results underline the essential importance of the regulative carboxyterminal region for Gap Junction channels build of Cx43 protein in vivo