Untersuchungen des pro-apoptotischen Proteins Par-4 und seiner Interaktionspartner Dlk, Amida und EFP1

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Methoden etabliert, mit denen die endogene Par-4-Expression entweder herauf- oder herunterreguliert werden kann. Es wurde gezeigt, dass die Induktion der endogenen Par-4-Expression durch die ER-Stress auslösenden Reagenzien Ionomycin, Thapsigargin und Tunicamycin in N2A- und NIH-3T3-Zellen ebenso wie die ektopische Koexpression von Par-4 und Dlk in REF52.2-Zellen zu einer verstärkten MLC-Phosphorylierung an der AS Serin19 führt. Eine siRNA-vermittelte Inhibition der Par-4-Expression kann die durch Ionomycin und Thapsigargin ausgelöste MLC-Phosphorylierung blockieren. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die Induktion der Par 4-Expression durch Thapsigargin zu einer Aktivierung der Caspase-3 in N2A-Zellen führt und dass die Inhibition von Par-4 die Apoptose-Induktion nach der Auslösung von ER-Stress in N2A- und in HeLa-Zellen blockieren kann. Die neue Par-4-Isoform Par-4/p33 aus embryonalen Stammzellen der Maus wurde als dominant-negative Par-4-Mutante in der Par 4/Dlk-vermittelten Apoptose identifiziert, wobei der Wirkmechanismus nicht aufgeklärt wurde. Anhand methylierungsspezifischer Promotoranalysen von Par-4 und seinen Interaktions-partnern Dlk/ZIPK und Amida/TFPT wurde gezeigt, dass der TFPT-Promotor sowohl in mehreren Tumorzellinien wie auch in primärem Gliomgewebe einen hohen Methylierungsgrad aufweist. Die DNA-Hypermethylierung korrelierte in primärem Glioblastomgewebe mit einer verringerten TFPT-Transkription, was eine epigenetische Stillegung des tfpt-Gens in diesen Tumoren vermuten lässt. Die Promotoranalysen des par-4-Gens zeigten, dass der Par-4-Promotor nur in den Gliom-Zellinien U251-MG und U373-MG hypermethyliert ist. In allen anderen untersuchten Tumorzellinien sowie in primärem Gliom-, Prostatakarzinom- und Mammakarzinomgewebe wurde keine bzw. nur eine schwache Par-4-Promotor-Hypermethylierung nachgewiesen. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die zipk-Genexpression in allen untersuchten Tumorzellinien und in primärem Gliomgewebe nicht durch Promotor-Hypermethylierung stillgelegt wird. Studien mit dem DNA-Demethylierungsreagenz 5-Aza-2`-deoxycitidin deuten jedoch darauf hin, dass sowohl das par-4- wie auch das zipk-Gen in den untersuchten Tumorzellinien indirekt durch DNA-Methylierung oder andere epigenetische Modifikationen reguliert werden könnte. Das in unserer Arbeitsgruppe als Interaktionspartner von Par-4 isolierte, Thioredoxin-ähnliche EFP1-Protein wurde als ER-ständiges Glykoprotein identifiziert. Die Hochregulation auf mRNA-Ebene nach Induktion von ER-Stress sowie die strukturellen Homologien zu Mitgliedern der PDI-Familie weisen dem EFP1-Protein eine Funktion bei der Protektion der Zelle vor ER-Stress zu. Obwohl keine Kolokalisation der Proteine EFP1 und Par-4 in CHO-Zellen beobachtet werden kann, führt die Koexpression von EFP1 und Par-4 in diesen Zellen, unabhängig von einer zusätzlichen Induktion von ER-Stress, zu einer signifikanten Steigerung der Par 4-vermittelten Apoptose. Möglicherweise agiert das EFP1-Protein als Vermittler zwischen ER-Stress und Par-4-induzierter Apoptose