Studien zur Funktion der Koaktivatoren ZIP-Kinase, AATF und TSG101 in der Androgenrezeptor-vermittelten Transkription

In unserer Arbeitsgruppe wurden mit der murinen ZIPK, dem Transkriptionsfaktor AATF und dem Ubiquitin-Bindeprotein TSG101 neue Koaktivatoren der AR-abhängigen Transkription identifiziert, deren funktionelle Kooperation in dieser Arbeit untersucht wurde. Dabei lag der Fokus auf der zeitlichen Abfolge und der gegenseitigen Abhängigkeit der Assemblierung des AR und der Koaktivatoren im Transkriptionsinitiationskomplex, sowie dem Mechanismus über den die ZIPK koaktivierend wirkt. Transiente Reportergenstudien bestätigten zunächst die humanen Orthologen als Koaktivatoren des AR. Die von der Kinaseaktivität abhängende koaktivierende Wirkung der ZIPK wurde für Enhancer- und Promotorbereiche von Zielgenen des AR und unter den Steroidhormonrezeptoren für die GR-, aber nicht die ER- und PR-vermittelte Transkription nachgewiesen. Auch die p53-abhängige Reportergenexpression wurde durch die ZIPK koaktiviert. Die Herunterregulation von ZIPK, AATF und TSG101 resultierte in verminderten mRNA-Leveln der endogenen AR-Zielgene PSA, KLK2 und TMPRSS2, was die endogenen Proteine als echte AR-Koaktivatoren klassifizierte. Die ZIPK zeigte dabei eine gewisse Zielgenspezifität, da das TMPRSS2-Gen von Überexpression und Reduktion der ZIPK unbeeinflusst blieb. Sequentielle Chromatin-Immunpräzipitations- (ChIP)-Analysen bestätigten, dass ZIPK, AATF und TSG101 in einem gemeinsamen Komplex mit dem AR an Enhancer- und Promotor-bereichen von AR-Zielgenen gebunden vorliegen. ChIP-Analysen nach siRNA-vermitteltem Knockdown von AATF zeigten, dass die Rekrutierung von TSG101 von AATF abhängt. Die Rekrutierung der ZIPK erfolgt dagegen direkt über den AR, wobei AATF stabilisierend wirkt. Die Assemblierung des AR und der Koaktivatoren an regulatorische Bereiche des PSA-, KLK2- und TMPRSS2-Gens erfolgte dynamisch in einer zyklischen Abfolge. Die Zykluslänge des AR betrug ca. 90 min, mit einem verkürzten ersten Zyklus von 30 min am PSA-Promotor. Die Koaktivatoren zeigten dabei ein deutlich dynamischeres Anlagerungs- und Dissoziations-verhalten. Innerhalb des AR-Zyklus fand eine mehrfache Assoziation und Dissoziation mit einem individuellen Rekrutierungsverhalten statt. Die in vitro von der ZIPK durchgeführte Phosphorylierung von Histon H3 an T11, welche ursprünglich als Mitose- und Centromerspezifisch beschrieben wurde (Preuss et al., 2003), konnte an den regulatorischen Regionen des PSA-, KLK2- und TMPRSS2-Gens als neue Histonmodifikation identifiziert, allerdings nicht der ZIPK zugeordnet werden. Die H3T11-Phosphorylierung erfolgte im Zuge der Genaktivierung noch vor der H3S10-Phosphorylierung und korrelierte mit der Demethylierung von H3K9. Um die Ursache für die zyklische Assoziation/Dissoziation des AR und der Koaktivatoren zu ermitteln wurden Proteasomen- oder Transkriptionsinhibitoren eingesetzt. Die Inhibition des Proteasoms bewirkte einerseits ein Ausbleiben der zyklischen Assoziation/Dissoziation und damit eine deutliche Akkumulation des AR an Response-Elementen, andererseits führte sie zur vollständigen Repression der AR-abhängigen Transkription von Reportergenen. Das zyklische Verhalten des AR kann somit auf den Abbau des AR zurückgeführt werden und ist für eine effiziente Transkription unerlässlich. Andererseits bewirkte die Inhibition der Transkription ebenso eine Akkumulation des AR. Daraus lässt sich schließen, dass die Initiation der Transkription eine Vorraussetzung für den Abbau darstellt und der Abbau wiederum die Vorraussetzung für eine erneute Transkriptionsinitiation. Interessanterweise führte die Herunterregulation der ZIPK ebenfalls zur Akkumulation des AR und von TSG101. Dieses Ergebnis wies auf eine Beteiligung der ZIPK an der Regulation des proteasomalen Abbaus des AR hin. Reportergenstudien zeigten einen funktionellen Zusammenhang zwischen der E3-Ligase Mdm2 und der ZIPK. In-vivo-Ubiquitinierungs-analysen nach Expression kinaseinaktiver ZIPK, sowie nach Herunterregulation endogener ZIPK führten zu einer verminderten Polyubiquitinierung des AR. Demgegenüber konnte nach ektopischer Expression der ZIPK eine Zunahme an polyubiquitiniertem AR detektiert werden. Der Nachweis einer schwachen Phosphorylierung von Mdm2 durch die ZIPK deutet eine Funktion der ZIPK in der Regulation der Mdm2-vermittelten Ubiquitinierung und damit dem Abbau des AR an, der vermutlich die Ursache des zyklischen Verhaltens des AR ist. Es lässt sich somit postulieren, dass das Zusammenspiel von AATF, TSG101 und ZIPK die Aktivität und den Abbau des AR reguliert. Nach Rekrutierung von ZIPK und AATF durch an den Enhancer/Promotor-gebundenen AR, rekrutiert AATF wiederum TSG101. Dieses wirkt koaktivierend, indem es die monoubiquitinierte, vermutlich aktive Form des AR stabilisiert. Nach erfolgter Transkriptionsinitiation ist die ZIPK an der Regulation des Ubiquitinierungs-zustandes des AR beteiligt, möglicherweise durch Aufhebung der Schutzwirkung von TSG101 und Aktivierung von Mdm2 durch Phosphorylierung, welches daraufhin die Polyubiquitinierung und damit den Abbau des AR einleitet. Dies bewirkt ein „Promotor-clearing“, welches dann die Bildung eines neuen Transkriptionsinitiationskomplexes ermöglicht