Functional analysis of bovine DNMT1 during bovine embryo development and its association with Bull fertility traits

This study was conducted to investigate the effects of suppressing and inhibiting DNMT1 on the embryonic development and bull fertility traits. In the first approach, in vitro produced zygotes were assigned randomly into four groups namely: those injected with Smartpool siRNA (SpsiRNA), 5aza-2’-deoxycytidine (5-AZA), nuclease free water and non-injected control. The proportions of different stages of embryos were assessed 48 and 72 hr post microinjection (pmi) while blastocyst rate was assessed at day 8 pmi. A second objective was to identify the effects of SNPs in DNMT1, DNMT3a and DNMT3b on bull fertility traits namely: non-return rate (NRR), sperm quality traits namely: sperm volume per ejaculate, sperm concentration, sperm motility, survivability after thawing, and sperm flow cytometric parameter namely: positive acrosome status (PAS), plasma membrane integrity (PMI) and DNA fragmentation index (DFI): and embryonic development in terms of time at first cleavage, late cleavage and blastocyst. For this, 310 breeding bull sperms obtained station and 350 embryos were genotyped at those loci using DNA samples. The proportions of the 8-cell embryos were lower in SpsiRNA and 5-AZA injected groups. The lowest total blastocyst rate was observed in 5-AZA treatment group. Microinjection of SpsiRNA has reduced the target mRNA by 80 and 50% in 8-cell and blastocyst stage embryos. Lower protein expression was also observed at 8-cell stage in embryos that were injected with SpsiRNA. The highest apoptotic index was found in SpsiRNA and 5-AZA injected groups. The microinjection of SpsiRNA and 5-AZA has increased the expression of IGF2 by 1.67 and 1.55 times. Analysis of variance revealed association of SNP of DNMT1 with NRR and PAS, while DNMT3a and DNMT3b were found to be associated with NRR as well as sperm motility. In addition, combined loci analysis of variance among DNMT1 x DNMT3a x DNMT3b showed significant association with NRR, sperm motility and survivability after thawing. SNP of DNMT1 gene was significant correlated with embryonic development. In conclusion, this gene evidently plays a critical role in bovine preimplantation and associates with bull fertility traits and embryonic development. Following validation of this result in an independent population, there is a great potential to use these loci as markers of fertility to enhance embryonic development.Funktionelle Analyse des bovinen DNMT1 während der embryonalen Entwicklung und seine Assoziation mit der Fruchtbarkeit von BullenDiese Studie wurde durchgeführt, um den repressiven und hemmenden Einfluss von DNMT1 (DNA methyltransferase 1) auf Merkmale der Bullenfruchtbarkeit und der embryonalen Entwicklung zu untersuchen. Im ersten Untersuchungsschritt wurden invitro erzeugte Zygoten zufällig in vier Gruppen aufgeteilt. Diese wurden mit drei unterschiedlichen Injektionen behandelt: der Injektion (a) mit Smartpool siRNA (SpsiRNA), (b) mit 5 aza-2’-deoxycytidine (5-AZA) und (c) mit Nuklease freiem Wasser. Gruppe 4 verblieb als unbehandelte Kontrolle bestehen. Das Verhältnis der unterschiedlichen Entwicklungsstadien der Embryonen wurde 48 und 72 hr post Mikroinjektion (pmi) erfasst, wohingegen die Rate der Blastocysten 8 Tage pmi aufgezeichnet wurde. Im zweiten Abschnitt dieser Forschungsarbeit wurde der Einfluss der SNP von DNMT1, DNMT3a und DNMT3b in zwei unterschiedlichen Merkmalskomplexen geprüft. Zum einen wurde die Fruchtbarkeit von Bullen an Hand der Parameter Non-Return-Rate (NNR), Spermienqualität, sowie Plasma Membran Integrität (PMI), Akrosomen Integrität (PAS) und DNA Integrität (DFI) untersucht. Des Weiteren standen Merkmale der Embryonalentwicklung im Mittelpunkt. Zu diesem Zweck wurden die DNA von 310 Spermienproben von Bullen und 350 Embryonen an den entsprechenden Genorten genotypisiert. Die Anzahl der sich um 8-Zell-Stadium befindlichen Embryonen 72 hr nach pmi war geringer in den Gruppen die mit SpsiRNA und 5-AZA injiziert wurden. Die geringste Blastocystenrate wurde in der mit 5-AZA behandelten Gruppe beobachtet. Mikroinjektion von SpsiRNA bewirkte eine Reduktion der Target mRNA in Blastocysten und 8-Zell-Embryonen. Die Mikroinjektion von SpsiRNA und 5-AZA steigerten die Expression von IGF2. Die Varianzanalyse wies eine Assoziation des SNP in DNMT1 mit NRR und PAS vor, während DNMT3a und DNMT3b einen signifikanten Einfluss auf NNR und Spermienmotilität hatten. Zusätzlich zeigte eine kombinierte Genort Varianzanalyse von DNMT1 x DNMT3a x DNMT3b einen signifikanten Effekt auf NNR, Spermienmotilität und Überlebenfähigkeit nach dem Auftauen. Das Gen DNMT1 spielt eine entscheidende Rolle in der bovinen Preimplantation und es lässt sich mit Merkmalen der Bullenfruchtbarkeit und embryonalen Entwicklung assoziieren. Dies könnte ein Hinweis auf einen nützlichen, genetischen Marker zur Verbesserung der Merkmale sein, der durch weitere unabhängige Studien bewiesen werden kann.