Engenharia genômica de linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae visando melhorar a fermentação de sacarose para a produção de álcool combustível no Brasil

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2013.Leveduras Saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente empregadas em diversos processos industriais como a produção de bebidas alcoólicas e etanol combustível graças à sua capacidade de fermentar açúcares eficientemente, mesmo em condições industriais. No Brasil, o etanol combustível é produzido a partir da fermentação do caldo de cana-de-açúcar ou melaço, contendo altas concentrações de sacarose. A principal via de utilização da sacarose pela levedura S. cerevisiae é através da hidrólise extracelular do açúcar, pela ação da enzima invertase extracelular (codificada pelos genes SUC), gerando monômeros de glicose mais frutose no meio de fermentação. Entretanto, a hidrólise extracelular do dissacarídeo é indesejada, pois contribui para incrementar o estresse osmótico das células, além de que os monossacarídeos liberados no meio podem servir de fonte de carbono para microrganismos contaminantes do processo fermentativo. Já foi descrito uma via alternativa de utilização da sacarose por S. cerevisiae, que consiste no transporte ativo deste dissacarídeo pelo simporte com H+ mediado pelo transportador AGT1, e posterior hidrólise intracelular pela ação de hidrolases como a invertase intracelular ou a-glicosidases. Esta via de utilização de sacarose é uma alternativa interessante, pois as células fermentariam a sacarose com maior eficiência para compensar o gasto energético do transporte do açúcar, gerando mais etanol. No presente trabalho, a levedura industrial diplóide CAT-1, isolada de dornas de fermentação, foi modificada genomicamente de forma a utilizar a sacarose somente por meio do transporte ativo e hidrólise intracelular. Para tal fim, foram construídas leveduras que expressassem constitutivamente a forma intracelular da invertase (PADH1::iSUC2) sem expressar a invertase extracelular (por exemplo através da deleção da segunda cópia do gene, suc2?), além da sobre-expressão do gene AGT1, característica indispensável para o funcionamento da via proposta. Com estas modificações inseridas nas leveduras industriais GMY08 e GMY15 foram obtidos incrementos na produção de etanol de aproximadamente 13%, redução de 50% na formação de glicerol, além de não haver o acúmulo de glicose e frutose no meio de fermentação. Para a aplicação direta das leveduras modificadas na indústria, foi necessário remover os marcadores heterólogos, submetendo as leveduras a diversos eventos de transformação e remoção de plasmídeos, que culminaram numa diminuição de 30% na atividade invertase intracelular. Por outro lado, a seleção de clones em meio rico contendo sacarose e antimicina A, fez com que a atividade de transporte de sacarose aumentasse 4 vezes em relação às linhagens parentais. Estas linhagens geneticamente modificadas sem marcadores (GMYwo) apresentaram um fenótipo de utilização lenta da sacarose, porém com um maior rendimento na conversão de substrato a etanol em relação a linhagem parental CAT-1. Também não foi observado secreção de glicerol, nem a presença de glicose e frutose extracelular. Estas leveduras geneticamente modificadas sem a presença de genes marcadores heterólogos poderão ser prontamente utilizadas para testes com mostos e condições industriais, como sistemas fermentativos de batelada alimentada com reciclo de células, contribuindo para aumentar a eficiência deste setor industrial.Abstract : Saccharomyces cerevisiae yeasts have been largely employed in various industrial processes such as production of alcoholic beverages or fuel ethanol due to their ability to ferment sugars efficiently, even under industrial conditions. In Brazil, fuel ethanol is produced from the fermentation of sugarcane juice or molasses, containing high concentrations of sucrose. The main pathway of sucrose utilization by S. cerevisiae yeasts is through extracellular hydrolysis of the sugar, by the action of the extracellular enzyme invertase (encoded by SUC genes), generating monomers of glucose plus fructose in the fermentation medium. However, the extracellular hydrolysis of the disaccharide is undesirable, since it contributes to increase the osmotic stress of cells, and the monosaccharides released into the medium can serve as carbon source for contaminant microorganisms of the fermentation process. An alternative pathway for sucrose utilization by S. cerevisiae has been described, involving the active transport of the disaccharide by H+ symport mediated by the AGT1 transporter, and subsequent intracellular hydrolysis by the action of hydrolases such as the intracellular invertase or a-glucosidase. This pathway of sucrose utilization is an interesting alternative, since the cells will ferment sucrose more efficiently to compensate the energy costs of transporting the sugar, producing more ethanol. In this study, the diploid industrial yeast CAT-1, isolated from fermentation vats, was genomically modified in order to utilize sucrose only by active transport and intracellular hydrolysis. To this end, yeasts were constructed that constitutively express the intracellular form of invertase (PADH1 :: iSUC2) without expressing the extracellular invertase (by deleting, for instance, the second copy of the gene, suc2?), besides over-expressing the AGT1 gene, an indispensable characteristic for the function of the proposed pathway. With these modifications inserted into the industrial yeasts GMY08 and GMY15 approximately 13% higher ethanol production levels were obtained, 50% reduction in the production of glycerol, besides no accumulation of glucose and fructose in the fermentation medium. For the direct application of the modified yeasts in industry, it was necessary to remove the heterologous markers by submitting the yeasts to several transformation events and removal of plasmids, which resulted in a 30% decrease in the intracellular invertase activity. Moreover, selection of clones in rich medium containing sucrose and antimycin A, allowed a four-fold increase in the sucrose transport activity compared to the parental strains. These genetically modified strains without markers (GMYwo) showed a slow sucrose utilization phenotype, although with higher substrate to ethanol conversion yields when compared to the parental strain CAT-1. It was also observed no secretion of glycerol, nor the presence of extracellular glucose and fructose. These genetically modified yeasts without the presence of heterologous gene markers can be readily used for testing musts and industrial conditions, such as fed-batch fermentation systems with cell recycle, contributing to increase the efficiency of this industrial sector