Inosina previne a resposta inflamatória e nociceptiva induzida pelo modelo experimental de esclerose múltipla

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2015.A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença autoimune mediada por linfócitos T e caracterizada por inflamação e degeneração do sistema nervoso central (SNC). As terapias atualmente disponíveis possuem ações parcialmente efetivas e inúmeras reações adversas. A inosina tem demonstrado importante ação imunomoduladora, neuroprotetora e anti-hiperalgésica. Neste sentido, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da inosina no desenvolvimento e progressão da encefalomielite autoimune experimental (EAE), o modelo experimental de EM. Métodos: Foram utilizados camundongos C57BL/6 fêmeas com 6 a 12 semanas. A EAE foi induzida pela inoculação de emulsão contendo glicoproteína de mielina do oligodendrócitos (MOG 35-55) suplementada com 500 µg de Mycobacterium tuberculosis (Mt) H37Ra em ambos os flancos traseiros nos dias 0 e 7. Em adição, cada animal recebeu 300 ng de Bordetella toxina Pertussis em 100 µL de solução salina por via intraperitoneal (i.p.) no dia 0 e no dia 2 pós-imunização (p.i.). Os animais foram tratados pela via i.p., 2x dia, com inosina (1 ou 10 mg/kg) ou solução salina (0,9% NaCl, 10 mL/kg). O tratamento, juntamente com a avaliação do peso corporal e dos sinais clínicos, ocorreu diariamente por 40 dias. Entre o 1º e 14º dia p.i. os animais foram submetidos a diferentes testes comportamentais a fim de avaliar a hiperalgesia mecânica e térmica ao frio, comportamento tipo-ansioso e depressivo e sinais tipo-fadiga. No 40º dia p.i., os animais foram eutanaziados; a medula espinhal foi coletada para a avaliação histológica do processo inflamatório e desmielinizante, imuno-histoquímica para atividade astrocitária e western blot para a expressão dos receptores A1 e A2A, proteína cinase ERK1 e p-ERK1; os linfonodos foram coletados para análise da citocina IL-17 por ELISA. Resultados: A indução da EAE foi evidenciada pela presença de sinais clínicos, a partir do 12° dia p.i. no grupo EAE + veículo. A inosina (1 e 10 mg/kg) retardou o surgimento dos escores clínicos e inibiu a progressão da doença, com destaque para a dose de 1 mg/kg. Além disso, a inosina na dose de 1 mg/kg inibiu a hiperalgesia mecânica e térmica ao frio, e a dose de 10 mg/kg inibiu apenas a hiperalgesia térmica evidenciadas durante a fase pré-motora da doença. Ainda observou-se que a EAE induziu comportamentos do tipo-ansioso no teste do labirinto em cruz elevado (LCE) e sinais tipo-fadiga no teste de nado forçado com sobrecarga durante a fase pré-motora da doença, os quais não foram revertidos pelo tratamento com inosina (1 mg/kg). Não observou-se comportamento tipo-depressivo nos animais EAE, poréma inosina (1 mg/kg) demonstrou efeito ansiolítico no teste de suspensão pela cauda (TSC). Além disso, verificou-se no teste do LCE ausência de alterações locomotoras no período avaliado. A análise histológica demonstrou que a inosina (1 e 10 mg/kg) bloqueou a neuroinflamação e a desmielinização, sendo a dose de 1mg/kg efetiva em inibir ainda a ativação astrocitária na medula espinhal após indução da EAE. Nos órgãos linfoides periféricos, a inosina (1 e 10 mg/kg) reduziu os níveis de IL-17 exacerbada pela EAE. Ademais, a EAE aumentou a expressão do A2AR na medula espinhal e a inosina (1 e 10 mg/kg) inibiu esse efeito. Em contrapartida, a indução da EAE culminou com a diminuição significativa na expressão de A1R no SNC, a qual não foi modulada pelo tratamento com inosina. A EAE não alterou a expressão da ERK1, porém aumentou, de maneira significativa, a expressão de p-ERK1 na medula espinhal no 40° dia p.i. Entretanto, o tratamento com inosina (1 e 10 mg/kg) não modulou a fosforilação de ERK1 no SNC. Conclusões: Os resultados do presente trabalho demonstram que a inosina, com destaque para a dose de 1 mg/kg, retardou e reduziu os sinais clínicos motores, bem como a hiperalgesia induzidos pela EAE. O efeito da inosina na dose de 1mg/kg ocorreu, em parte, pela inibição da neuroinflamação e desmielinização, bem como por redução da atividade astrocitária, do nível de IL-17 em tecido linfoide periférico e expressão do A2AR no SNC.Abstract : Multiple Sclerosis (MS) is a T cells-autoimmune, inflammatory and demyelinating disease of the central nervous system (CNS). Currently available therapies have partially effective actions and numerous side reactions. Inosine showed immunomodulatory, neuroprotective and anti-hyperalgesic action. The aim of this study was to evaluate the inosine effect in the development and progression of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a MS experimental model. Methods: Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) was induced in female C57BL/6 mice (6?10 weeks of age) by immunization with MOG 35-55 peptide supplemented with 500 µg of Mycobacterium tuberculosis extract H37Ra into the flanks on days 0 and 7. All animals were also injected intraperitoneally (i.p.) on days 0 and 2 with 300 ng of Pertussis toxin. During 40 days, the animals received inosine (1 or 10 mg/kg) or saline solution (0,9% NaCl, 10 mL/kg). The weight and clinical signs were evaluated daily. Among 1 and 14 days post immunization (p.i.) animals were subjected to different behavioral tests to evaluate the mechanical and cold thermal hyperalgesia, anxious and depressive-like behavior and fatigue-like signs. Forty days p.i., the animals were euthanized; the spinal cord was collected for inflammatory and demyelinating histological evaluation, astrocyte activity immunohistochemistry and expression of A1 and A2A receptors, protein kinase ERK1 and p-ERK1 by western blot; lymph nodes were collected for IL-17 cytokine analysis by ELISA assay. Results: In this present study, we report that EAE induction has been evidenced by clinical signs appeared on day 12 p.i. on EAE + vehicle group. Inosine (1 and 10 mg/kg) delayed the scores onset as well as the disease progression and weight loss, particularly at 1 mg/kg dose. Furthermore, inosine 1 mg/kg inhibited mechanical and cold thermal hyperalgesia, 10 mg/kg dose inhibited only thermal allodynia evidenced during the pre-motor stage of the disease. It was also found that EAE induced anxious-like behavior on the elevated plus maze test (ECL) and fatigue-like sign in the weight load swimming test (WLST) on the pre-motor stage, which were not reversed by treatment with inosine (1mg/kg). It was not observed depressive-like behavior in EAE + vehicle group, however, inosine (1 mg/kg) showed anxiolytic effect in the tail suspension test (TST). In addition, it was found in the EPM test lack of locomotor changes on the evaluated period. Histological analysis showed that inosine (1 and 10 mg/kg) blocked neuroinflammation anddemyelination in the spinal cord after EAE induction, and 1mg/kg inosine also inhibited astrocytic activity. In the secondary lymphoid tissue, inosine (1 and 10 mg/kg) inhibited the IL-17 levels exacerbated by EAE. Furthermore, EAE increased A2AR expression in the spinal cord and inosine (1 and 10 mg/kg) inhibit this up-regulation. On the order hand, EAE immunization induced down-regulation of A1R in the CNS, which was not modulated by inosine treatment. EAE did not alter the ERK1 expression, but increased p-ERK1 expression in the spinal cord at day 40 p.i. Treatment with inosine (1 and 10 mg/kg) did not modulate the ERK1 phosphorylation in the CNS. Conclusions: These results indicate that inosine, with emphasis on the 1mg/kg dose, delayed and reduced EAE clinical symptoms and hyperalgesia. The inosine effect is mediated, in part, by reducing neuroinflammation and demyelination, as well as reduction of astrocytic activity, IL-17 levels and A2ARs expression