Pharmakologische Modulation der Ionenkanäle TRPV2, TRPV3 und TRPV4

Die Ionenkanäle TRPV2, TRPV3 und TRPV4 sind an diversen physiologischen und pathologischen Vorgängen beteiligt, wodurch sie zu einer potentiellen pharmakologischen Zielstruktur werden. Zur Identifikation von Modulatoren mit einer erwünschten Wirkung an diesen Zielstrukturen, hat sich das Screening von Substanzbibliotheken bewährt, sodass auch wir auf diese Methode zurückgriffen. Die Substanzbibliothek Spectrum Collection umfasst neben 800 Naturstoffen und 160 Toxinen auch 1040 zugelassene oder klinisch geprüfte Medikamente, welche den Vorteil bieten, dass bereits Daten zur Pharmakokinetik und -dynamik vorhanden sind. Für die Untersuchungen entstanden mittels Transfektion murine TRPV2-, TRPV3- und TRPV4-über¬exprimierende humane embryonale Nierenzelllinien (HEK293-Zellen). In die Parentalzelllinie wurden Vektoren eingebracht, welche neben einer für das jeweilige Kanalprotein codierenden Sequenz u.a. auch einen CFP oder YFP Tag aufwiesen. Diese Markierung ermöglichte eine Kontrolle der Expression und der subzellulären Lokalisation. Das Screening der Spectrum Collection lieferte 61 (TRPV2), 68 (TRPV3) und 28 (TRPV4) Substanzen mit aktivierendem bzw. inhibitorischem Effekt. Im Anschluss an das Primärscreening war die Durchführung eines Sekundärscreenings notwendig. Am Ende dieses Selektionsprozesses standen Alverincitrat, Valdecoxib und Maprotilin. Es folgten weitere Untersuchungen zur Selektivität innerhalb der TRPV-Subfamilie. Alverincitrat ist ein nichtatropinerges Relaxans der glatten Muskulatur, welches in Großbritannien als Spasmolytikum u.a. zur Behandlung des Reizdarmsyndroms sowie der Dysmenorrhoe zugelassen ist. Alverincitrat zeigte einen blockierenden Effekt auf TRPV2 und TRPV4. Valdecoxib, welches als COX-2-Hemmer verbreitet als Analgetikum und Antiphlogistikum eingesetzt wird, fiel durch eine Blockierung des TRPV2-vermittelten intrazellulären Calciumionenanstiegs auf. Für Valdecoxib wurde eine halbmaximale inhibitorische Konzentration von 43,5 µM bestimmt. An TRPV3-Ionenkanälen hingegen zeigte sich eine Potenzierung des aktivatorinduzierten [Ca2+]i -Signals durch Valdecoxib. Aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit prüften wir, ob dieser konzentrationsabhängige Effekt auch durch andere COX-2-Hemmer, konkret Deracoxib und Rofecoxib, hervorgerufen werden kann. Für Rofecoxib wurde kein Einfluss auf TRPV3-Ionenkanäle detektiert. Deracoxib führte zu einer im Vergleich zu Valdecoxib sogar noch stärkeren Potenzierung des 2-APB-getriggerten, TRPV3-vermittelten Anstiegs der [Ca2+]i. Als nichtselektiver Monamin-Wiederaufnahme-Hemmer ist das tetrazyklische Anti-depressivum Maprotilin seit ca. 30 Jahren zur Behandlung depressiver Erkrankungen zugelassen. Wir beobachteten eine Inhibierung der GSK1016790A-induzierten TRPV4-Aktivierung durch Maprotilin. Die Ionenkanäle TRPV2, TRPV3 und TRPV4 sind von physiologischer bzw. pathophysiologischer Relevanz für den menschlichen Organismus und stellen somit eine geeignete pharmakologische Zielstruktur dar. Es sind zwar einige teils spezifische Aktivatoren und Blocker für TRPV2, TRPV3 und TRPV4 bekannt, diese sind jedoch bisher nicht zugelassen und damit nicht therapeutisch einsetzbar Neben dem therapeutischen Einsatz könnten die identifizierten Modulatoren auch zum Erstellen von Struktur-Wirkungsbeziehungen genutzt werden, durch die chemische Substrukturen ermittelt werden, welche für gewünschte sowie unerwünschte Wirkungen essentiell sind. Des Weiteren ist ein Einsatz der Modulatoren als zellbiologische Werkzeuge denkbar, wodurch neue Erkenntnisse über die physiologische und pathophysiologische Relevanz von TRPV2, TRPV3 und TRPV4 sowohl auf zellulärer als auch auf systemischer Ebene gewonnen werden könnten.:Inhaltsverzeichnis 1 Abkürzungsverzeichnis 3 1 Einführung 5 1.1 Die Familie der TRP-Ionenkanäle 5 1.2 Die TRPV-Subfamilie 8 1.3 TRPV2 8 1.4 TRPV3 12 1.5 TRPV4 15 2 Aufgabenstellung 20 3 Material und Methoden 21 2.1 Zellkultur 21 2.2 Laser-Scanning-Mikroskopie 22 2.3 Ca2+ -Assays 22 2.4 Spectrum Collection 26 4 Ergebnisse 28 3.1 Subzelluläre Lokalisation von TRPV2, TRPV3 und TRPV4 28 3.2 Funktionelle Expression 29 3.3 Screening der Spectrum Collection 31 3.4 Alverincitrat 36 3.5 Valdecoxib 39 3.6 Maprotilin 44 5 Diskussion 48 4.1 TRPV4 48 4.2 TRPV2 53 4.3 TRPV3 55 4.4 Ausblick 59 6 Zusammenfassung der Arbeit 61 7 Literaturverzeichnis 66 8 Curriculum vitae Fehler! Textmarke nicht definiert. 9 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 79 10 Danksagung 80