PHYSICAL-CHEMICAL CHARACTERIZATION OF POLYSACCHARIDES AND THEIR INTERACTION WITH PROTEINS

I glicosamminoglicani sono polisaccaridi lineari ad alta densità di carica negativa, caratteristica che permette loro di interagire facilmente con proteine e grazie a questa interazione sono in grado di svolgere importanti funzioni biologiche oltre che di esercitare attività farmacologiche; ad esempio leparina grazie alla sua interazione specifica con la proteina antitrombina è uno dei più potenti e utilizzati farmaci anticoagulanti. Il presente lavoro di tesi si propone di caratterizzare principalmente glicosamminoglicani e loro miscele, seguendo due linee di ricerca. La prima linea di ricerca, oggetto dei primi due anni di dottorato, è consistita nello studio, validazione e ottimizzazione di metodi cromatografici per esclusione dimensionale volti alla valutazione della distribuzione di peso molecolare di campioni di eparina a diversa lunghezza di catena e provenienti da differenti sorgenti animali (primo anno), e di miscele di eparina e dermatan solfato (secondo anno). Questo studio nasce considerando la natura eterogena e polidispersa dei polisaccaridi, per i quali la distribuzione del peso molecolare ricopre un ruolo fondamentale nella loro applicabilità in campo farmacologico; da qui, la necessità di avere metodiche in grado di valutare questo parametro il più correttamente possibile. A tale scopo sono stati presi in considerazione e sono stati comparati sia metodi richiedenti una classica calibrazione convenzionale, consistenti nella costruzione di una curva di calibrazione con un set di standard certificati, e conseguente ottenimento di una distribuzione dei pesi molecolari relativa alla curva, sia metodi assoluti che richiedono un detector come il Light Scattering che non necessita di alcuna calibrazione delle colonne cromatografiche utilizzate e valuta il peso molecolare dallo scattering delle particelle in soluzione. La seconda linea di ricerca, sviluppata lungo tutti e tre gli anni di dottorato, ruota attorno alla caratterizzazione chimico-fisica del complesso eparina/fattore piastrinico 4 (PF4), causa di uno dei peggiori effetti collaterali associati alla terapia con eparina, la Trombocitopenia eparina-indotta (HIT). Poiché tale complesso è influenzato sia dalla lunghezza di catena delleparina, sia dalla sua carica superficiale, le due principali tecniche utilizzate per studiarlo sono state la Spettroscopia di Correlazione Fotonica (PCS) e la valutazione del Potenziale Zeta, sviluppando ed ottimizzando dei metodi basati sulla titolazione di una concentrazione fissa di PF4 con diverse concentrazioni di eparina volti non solo allottenimento di una indicazione sul rapporto proteina/eparina (PHR) considerabile massimo per la formazione di un complesso riconoscibile da quegli anticorpi scatenanti HIT, ma anche in grado di discriminare tra eparine a diversa lunghezza di catena (primo anno). Tali metodiche sono state poi validate anche per miscele più complesse e per polisaccaridi non appartenenti alla famiglia dei glicosamminoglicani (terzo anno). Infine, è stata ottenuta una prima valutazione dei parametri termodinamici dellinterazione eparina/PF4 mediante Titolazione Calorimetrica Isotermica (ITC) volta allo sviluppo di un metodo in grado di distinguere eparine a diversa lunghezza di catena (secondo anno), tecnica ripresa anche per la valutazione termodinamica di polisaccaridi non appartenenti alla famiglia dei glicosamminoglicani (terzo anno)