Abordagens biotecnológicas para a caracterização, conservação, propagação e avaliação genotípica de plantas in vitro de abacaxizeiro

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agráricas, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2015.O abacaxizeiro comercial (Ananas comosus var. comosus), pertencente à família Bromeliaceae, teve iniciada sua domesticação no norte da América do Sul entre 6.000 e 10.000 anos atrás. Em 1492, quando os europeus chegaram às Américas, o abacaxizeiro já estava disperso por toda a América tropical e parte da subtropical. Nos séculos seguintes ele foi espalhado pelo mundo e se consolidou como uma espécie frutífera de importância econômica mundial. A produção comercial desta cultura repousa sobre uma estreita base genética e tem como principais fontes de propágulos mudas reproduzidas vegetativamente, as quais podem disseminar pragas e doenças. Ferramentas biotecnológicas compreendem um expressivo arranjo de tecnologias que podem auxiliar a caracterização, o melhoramento e a multiplicação rápida e massiva de genótipos de abacaxizeiro. Neste sentido, um maior conhecimento sobre a diversidade genética existente na espécie pode possibilitar a expansão da oferta de genótipos para o plantio comercial, ao mesmo tempo em que possibilita uma maior eficiência no planejamento e na execução de programas de melhoramento genético e de conservação de germoplasma. Por sua vez, técnicas de micropropagação possibilitam a propagação rápida e em larga escala de mudas isentas de pragas e doenças a partir de genótipos-elite, configurando alta qualidade fitossanitária e genética. Entretanto, as mudas micropropagadas de abacaxizeiro normalmente apresentam um alto custo quando comparado ao custo das mudas produzidas via reprodução vegetativa convencional. Desta forma, a combinação de altas taxas regenerativas associadas ao emprego do meio de cultura líquido em um protocolo de organogênese convencional em imersão permanente e ao protocolo via culturas nodulares (CN) em sistemas de imersão temporária podem se configurar em avanços expressivos na micropropagação do abacaxizeiro, desde que eles mantenham a fidelidade genética das plantas regeneradas. Levando em conta estes aspectos, a presente tese objetivou: a) analisar o nível de ploidia do abacaxizeiro ?Gigante de Tarauacá?, variedade tradicional do estado do Acre; b) aperfeiçoar o protocolo baseado em CN associadas a sistemas de imersão temporária na fase de crescimento de brotos; c) estudar os níveis de metilação do DNA global (NMDG) e os incrementos de massa fresca (IMF) durante as fases de multiplicação de CN e de diferenciação de CN para microbrotos, bem como avaliar por meio das análises de AFLP, nível de ploidia e de características morfológicas a fidelidade genética das mudas oriundas deste sistema regenerativo; e, d) analisar por meio de características morfológicas a fidelidade genética de plantas jovens e adultas que foram micropropagadas ao logo de sucessivas repicagens via organogênese convencional em imersão permanente e via CN associadas a sistemas de imersão temporária. Os resultados obtidos mostram que: a) a cultivar ?Gigante de Tarauacá? é triplóide (2n=3x=75); b) o sistema de imersão temporária em frascos duplos associado ao meio de cultura livre de fitorreguladores na fase de crescimento de brotos alia alta eficiência regenerativa e sincronismo no desenvolvimento de brotos vigorosos; c) os NMDG apresentaram-se dinâmicos nas duas fases estudadas e estavam associados ao IMF e a idade das culturas, por sua vez, as análises baseadas em AFLP, nível de ploidia e em características morfológicas indicaram que as plantas regeneradas mantiveram-se homogêneas; e, d) plantas de A. comosus var. comosus regeneradas via organogênese convencional e via CN mostraram-se homogêneas entre si, enquanto plantas da var. bracteatus regeneradas via organogênese convencional apresentaram uma maior susceptibilidade à ocorrência de variações morfológicas. Tomados em conjunto, os resultados da presente tese ampliam o conhecimento associado ao uso, conservação e melhoramento do abacaxizeiro.Abstract : The domestication of commercial Pineapple (Ananas comosus var. comosus), belonging to the Bromeliaceae family, started between 6000 and 10000 years ago in the Guiana?s Shield. In 1492, when Europeans arrived in America, Pineapple was spread in low lands of the tropical America and regions of the subtropical America. In the following centuries Pineapple was spread in the world and was consolidated as one of the world?s most economically important fruit species. The commercial production of this species is based in a narrow genetic base and the conventional vegetative propagation based on suckers allows the dissemination of pest and diseases. Biotechnological tools include an expressive arrangement of technologies that can assist the characterization, the improvement, and the fast and massive micropropagation of selected pineapple genotypes. In this way, a better knowledge about the genetic diversity in this species may allow the expansion of the genotypes used in commercial plantation, at the same time allowing a higher efficiency in the planning and execution of genetic improvement and conservation programs. In turn micropropagation techniques allow the fast and massive production of pest- and disease-free stock plants from elite genotypes, resulting in plantlets with high genetic and phytosanitary quality. However, the micropropagated plantlets present higher costs when compared to the vegetative stocks production costs. In this way, the combination of high regenerative rates associated with permanent immersion in liquid medium for conventional organogenesis or use of temporary immersion with bioreactors for nodule cluster cultures (NC) micropropagation may result in significant advances for pineapple micropropagation. However genetic fidelity must be guaranteed for regenerated plants. Taking these aspects into account, the present thesis aimed at: a) to analyze the ploidy level of pineapple ?Gigante de Tarauacá?, a traditional landrace from Acre state, North Brazil; b) to improve the protocol via NC associated with bioreactors of temporary immersion systems in the phase of shoots elongation; c) to study the global DNA methylation levels (GDML) and the fresh mass increase ratio (FMIR) during NC multiplication and differentiation to microshoots, as well as to evaluate the genetic fidelity through the analyzes of AFLP, ploidy level and morphological characteristics of regenerated plants; d) to analyze the genetic fidelity through morphological characteristics in young and adults plants that were micropropagated over successive subcultures via conventional organogenesis in permanent immersion and via NC associated with temporary immersion systems. The results showed that: a) the cultivar ?Gigante de Tarauacá? is triploid (2n=3x=75); b) the twin flask temporary immersion system associated with culture medium free of plant growth regulation in the phase of shoots elongation combine high regenerative efficiency and synchronism in the development of vigorous shoots; c) the GDML in both phases were dynamics and associated to the FMIR and to the cultures age, in turn, the analysis of AFLP, ploidy level and morphological features indicated homogeneity in the regenerated plants; and d) regenerated plants of A. comosus var. comosus via conventional organogenesis and via NC showed homogeneity between them, while regenerated plants of A. comosus var. bracteatus via conventional organogenesis showed a higher susceptibility to the occurrence of variant plants. Taking together, the results of this thesis expand the knowledge associated with the use, conservation and genetic improvement of pineapple