Engenharia evolutiva e genômica de leveduras Saccharomyces cerevisiae recombinantes fermentadoras de xilose

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2015Produzidos a partir de fontes renováveis e utilizados para o transporte automotivo, os biocombustíveis tornam-se cada dia mais importantes no balanço energético mundial devido à necessidade de reduzir a dependência da utilização de petróleo, de origem fóssil. No Brasil, a maior parte da produção de bioetanol é obtida diretamente a partir da cana-de-açúcar, porém, na pouco aproveitada biomassa lignocelulósica residual (como bagaço e palha) encontra-se a xilose, o segundo açúcar mais abundante na natureza. A conversão bem sucedida da hemicelulose em etanol combustível com alto rendimento é o fator decisivo para a viabilidade econômica do processo. Saccharomyces cerevisiae é um microrganismo altamente efetivo na produção de etanol a partir de hexoses, com elevada produtividade de etanol, alta tolerância a esse produto, e tolerância às condições industriais de produção de álcool combustível, mas incapaz de utilizar açúcares como a xilose. Linhagens recombinantes de S. cerevisiae podem constituir uma alternativa interessante para a fermentação da xilose. Assim, no presente trabalho, foram usadas linhagens de S. cerevisiae recombinantes capazes de metabolizar xilose, transformadas com o plasmídeo integrativo pAUR-XKXDHXR, o qual permite a sobre-expressão dos genes das enzimas xilose redutase, xilitol desidrogenase e xilulose cinase. Em primeira abordagem, foi realizado um experimento de engenharia evolutiva com uma linhagem contendo apenas o gene do transportador de glicose HXT2 sobre-expresso, permitindo a obtenção de uma linhagem mutante no gene STB5, que codifica um regulador da via das pentoses-fosfato. Esta linhagem mutante foi capaz de crescer em xilose tão bem quanto em glicose. Em segunda abordagem, usando engenharia genômica, foi deletada uma cópia do gene FPS1, o qual codifica um facilitador de glicerol, em uma linhagem industrial selecionada para eficiente fermentação de caldo de cana-de-açúcar, obtendo-se uma linhagem que fermenta a xilose mais eficientemente. Nossos resultados revelam que as estratégias empregadas são promissórias para incrementar consideravelmente a produção de etanol a partir de linhagens de S. cerevisiae recombinantes.Abstract: Biofuels produced from renewable sources and used for automotive transport are becoming increasingly more important in the global energy mix, looks for decrease world's oil dependency comes from fossil sources use. Most of the Brazilian ethanol production is obtained directly from sugar cane, however, it don't take advantage of the residual lignocellulosic biomass coming from this process (such as bagasse and straw) which is rich in xylose, the second most abundant sugar in nature. The successful conversion of hemicellulose (compound of lignocellulose) into ethanol fuel with high yields is the decisive factor for economic feasibility of its use. Saccharomyces cerevisiae is a highly effective microorganism for ethanol production from hexoses, which poses high ethanol productivity and high tolerance to it, and tolerance to industrial conditions in alcohol fuel production, but is not able to use sugars such as xylose. Recombinant strains of S. cerevisiae may constitute an interesting alternative to xylose fermentation. In this research work was used two strains of recombinant S. cerevisiae, capables of metabolize xylose, transformed with the integrative plasmid pAUR-XKXDHXR which permits overexpression of enzyme genes xylose reductase, xylitol dehydrogenase and xylulose kinase. In first approach, an evolutive engineering experiment was carried out with a strain that only had a transporter gene of glucose HXT2 overexpressed, turned out to be in a mutant strain in the STB5 gene that encodes for a regulator pentose-phosphate pathway, mutant lineage capable of grow in xylose efficiently as in glucose. In second approach, using genetic engineering, was deleted a copy of FPS1 gene which encodes a glycerol facilitator in a selected industrial strain for efficient fermentation of sugar cane broth, coming out a strain that ferments xylose more efficiently. Our results reveal as promissory the strategies used for important increase of ethanol production from recombinant lineages of S. cerevisiae