Avaliação da atividade tripanocida e leishmanicida de produtos naturais da flora mato-grossense

TCC(graduação) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Biologia.O arsenal quimioterápico disponível para o tratamento da Doença de Chagas e das Leishmanioses é restrito a poucos fármacos, os quais apresentam eficácia limitada e efeitos colaterais indesejáveis. A biodiversidade de plantas brasileiras representa uma rica fonte para a busca por novos compostos com potencial antiparasitário. Neste estudo, 20 extratos, 8 frações e 2 compostos isolados da flora mato-grossense foram avaliados. As amostras foram solubilizadas em DMSO (50mg/ml) e mantidas a 4o C até o uso. Promastigotas de Leishmania amazonensis (cepa 575) e L. chagasi (cepa PP75), e epimastigotas de Trypanosoma cruzi (cepa Y) (5x106 parasitos/ml), mantidos respectivamente em meio Schneider e LIT, forma incubados em triplicata em placas de 96 orifícios a 26o C com diferentes concentrações dos produtos naturais (1,6 a 1000 μg/ml). Após 72h de incubação, a atividade contra T. cruzi foi determinada pela contagem do número de parasitos vivos em câmara de Neubauer, e a atividade leishmanicida foi determinada pelo método de MTT. Anfotericina B (0,1μM) e Benzonidazol (10μg/ml), e DMSO 1% foram usados como controles positivo e negativo, respectivamente. Os produtos ativos contra epimastigotas de T. cruzi foram incubados com tripomastigotas sanguíneos (1x106 parasitos/ml) a 4o C, usando cristal violeta e DMSO 1% como controles positivo e negativo, e a sobrevivência dos parasitos foi determinada após 48h. A avaliação in vitro da atividade leishmanicida contra amastigotas intracelulares foi realizada com células J774-A1 infectadas com L. amazonensis em placas de 96 orifícios na presença de diferentes concentrações dos produtos naturais por 48 horas. As monocamadas foram fixadas com metanol e coradas com Giemsa, e o número de amastigotas intracelulares foi determinado pela avaliação randômica de 200 células. A citotoxicidade das amostras ativas foi avaliada usando células J774-A1 (2x104 células/orifício) pelo método de MTT. Todos os ensaios forma realizados duas vezes, em triplicata. Dois extratos hexânicos (Xilopia aromatica e Aspidosperma cuspa) e uma fração (“Ipê Pimenta”) apresentaram atividade tripanocida contra epimastigotas (CI50 = 87,07; 66,41 e 100,46 μg/ml, respectivamente), e o extrato hexânico de A. cuspa foi ativo contra tripomastigotas sangüíneos (CI50 = 150,62 μg/ml). Quatro extratos hexânicos (X. aromatica, Bowdichia virgiloides, A. cuspa e Acosmium dasycarpum), duas frações de Zanthoxylum hasslerianum e o composto isolado Cumarina foram ativos contra promatigotas de L. amazonensis (CI50 = 15,52 – 120,9 μg/ml) e L. chagasi (CI50 = 3,976 – 166,40 μg/ml). Desses, apenas o extrato hexânico de A. dasycarpum não apresentou atividade em testes com amastigotas intracelulares de L. amazonensis, sendo que os demais produtos testados apresentaram inibição acima de 40% nas concentrações de 1,6, 8 e 40 μg/ml. Nenhum dos extratos ativos foi citotóxico para células J774-A1 acima de 90 μg/ml.The chemotherapy arsenal available for treatment of Chagas disease and leishmaniasis is restricted to few drugs which presented limited efficacy and show undesirable side effects. The Brazilian plant biodiversity represents a rich source of new potential antiparasitic compounds. In this study the trypanocidal and leishmanicidal activity of 20 extracts, 8 fractions and 2 isolated compounds from Mato Grosso State plants was evaluated. Samples were solubilized in DMSO (50mg/ml) and maintained at 4ºC until use. Promastigotes of Leishmania amazonensis (575 strain) and L. chagasi (PP75 strain), and epimastigotes of Trypanosoma cruzi (Y strain) (5x106 cells/ml), maintained respectively in Schneider’s and LIT medium, were incubated in triplicate in 96-well microplates at 26ºC with different concentrations of natural products (1.6 to 1,000μg/ml). After 72h of incubation, the activity was determined by counting the number of live parasites in Neubauer chambers (T. cruzi) and by MTT method (Leishmania sp). Amphotericin B (0.1μM) and Benzonidazol (10μg/ml), and DMSO 1% were used as positive and negative controls, respectively. Products active against epimastigotes were incubated with blood trypomastigotes (1x106 cells/ml) at 4oC, using violet cristal and DMSO 1% as positive and negative controls, and survival parasites determined after 48h. The in vitro evaluation of leishmanicidal activity against intracellular amastigotes was realized by using J774.A1 cultures infected with L. amazonensis in 96-well plates in the presence of different natural products dilutions for 48 hours. The monolayers were fixed with methanol and Giemsa stained, and intracellular amastigote numbers were determined in 200 randomly chosen cells. Citotoxicity of active extracts was evaluated using J774.A1 cells (2x104 cells/well) by the MTT method. All assays were performed two times in triplicate. Two tested hexanic extracts (Xilopia aromatica and Aspidosperma cuspa) and a fraction (“Ipê Pimenta”) showed trypanocidal activity for epimastigotes (IC50 = 87.07; 66.41 e 100.46 μg/ml, respectively) and hexanic extract of A. cuspa was active against blood trypomastigotes (IC50 = 150.62 μg/ml).. Four hexanic extracts (X. aromatica, Bowdichia virgiloides, A. cuspa and Acosmium dasycarpum), two fractions of Zanthoxylum hasslerianum and the isolated compound Coumarin were active against L. amazonensis (IC50 = 15.52 – 120.9 μg/ml) and L. chagasi (IC50 = 3.976 – 166.40 μg/ml) promastigotes. From this, only the hexanic extract of A. dasycarpum didn’t show activity on tests with L. amazonensis intracelular amastigotes, and the other tested products showed inhibition up to 40% on 1.6, 8 and 40 μg/ml. The extracts, fractions and isolated compounds apresent low citotoxicity for J774.A1 cells up to 90 μg/ml