Toxicidade celular e bioquímica do glifosato sobre ovários de peixe Danio rerio

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2014Glifosato é um dos herbicidas mais usados no Brasil, sendo altamente solúvel em água e quando aplicado em ambiente terrestre e aéreo pode ocorrer a sua infiltração no solo e a percolação para os corpos d'água, atingindo diferentes organismos aquáticos não-alvos, como invertebrados e vertebrados. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do glifosato, na concentração de 65 µg/L, sobre a organização estrutural e ultraestrutural, bem como sobre os parâmetros bioquímicos de toxicidade nos ovários do peixe Danio rerio. Esta concentração foi estabelecida pelo CONAMA como a máxima permitida para os rios do Brasil. As células germinativas foram caracterizadas em quatro fases: ovogônia, ovócito pré-vitelogênico I, ovócito pré-vitelogênico II e ovócito vitelogênico, baseado em critérios morfológicos já estabelecidos na literatura. Verificou-se um aumento significativo no diâmetro dos ovócitos pré-vitelogênicos I e nos ovócitos vitelogênicos, assim como um aumento significativo no índice gonadossomático (IGS) em ovários de peixes expostos ao glifosato por um período de 15 dias (exposição subcrônica). Na análise estrutural das células germinativas não foram identificadas alterações morfológicas, porém na análise ultraestrutural, observou-se no citoplasma dos ovócitos formações membranosas concêntricas tipo myelin-like, associadas aos grânulos de vitelo periféricos, além de alterações nas cisterna dos corpos de Golgi. Houve também redução do número de mitocôndrias e cristas mitocondriais nas células foliculares. Constatou-se maior expressão de SF-1, em ovários expostos ao glifosato. Identificou-se também um aumento significativo no número de células imunomarcadas com o anticorpo anti-Bak, porém um número significativamente menor de células imunomarcadas com o anticorpo anti-Bcl2. Na exposição dos peixes ao glifosato por um período de 96 h (exposição aguda), identificou-se redução nos níveis de tióis não proteicos (NPSH) e um aumento significativo nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), caracterizando estresse oxidativo. Na exposição por um período de 360 h (15 dias), não houve a caracterização de estresse oxidativo. Mesmo na concentração de glifosato regulamentada para os rios do Brasil, efeitos subletais foram identificados nos ovários, sendo reconhecidos usando ferramentas bioquímicas e ultraestruturais. Desta forma, estas análises devem ser realizadas em testes toxicológicos na avaliação de parâmetros reprodutivos. Os efeitos adversos do glifosato sobre os ovócitos e as células foliculares demonstradas aqui representam um importante risco para a reprodução de peixes.Abstract: Glyphosate is one of the most commonly used herbicides in Brazil, being highly soluble in water and when applied in aerial and terrestrial environment can occur its infiltration into the soil and the percolation to the bodies of water, reaching different non-target aquatic organisms, such as invertebrates and vertebrates. The main goal of this study was to evaluate the effects of glyphosate, at a concentration of 65 µg/L, on structural and ultra-structural organization, as well as on the biochemical parameters of toxicity on the ovaries of the fish Danio rerio. This concentration was established by CONAMA as the maximum allowable for the Brazilian rivers. The germ cells were characterized in four stages: oogonia, previtellogenic I oocyte, previtellogenic II oocyte and vitellogenic oocyte, based on morphological criteria previously established on the literature. A significant increase on the diameter of the previtellogenic I and vitellogenic oocytes was verified, as well as a significant increase in the gonadosomatic index (GSI) in the ovaries of the fish exposed to the glyphosate for a 15 days period (sub-chronic exposure). In the structural analysis of the germ cells, morphologic changes were not identified. However, in ultrastructural analysis, concentric membranous formation of myelin-like kind were observed on the cytoplasm of the oocytes, associated to the peripheral yolk granules, and also morphological change Golgi cisterns. In follicular cells reduction on the number of mitochondria and mitochondrial cristae observed. In this analysis, it was also observed with. It was observed greater SF-1 expression in ovaries exposed to glyphosate. It was also identified a significant increase in the number of immunostained cells with the anti-Bak antibody, but a significantly lower number of immunostained cells with antibody anti-Bcl2. On exposure of fish to glyphosate for 96 hours (acute exposure), it was identified a reduction in levels of non-protein sulfhydryl (NPSH) and a significant increase in levels of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), featuring oxidative stress. On exposure of a period of 360 hours (15 days), there was no characterization of oxidative stress. Even with the glyphosate concentration regulated to Brazil's rivers, sublethal effects were identified on the ovaries, being recognized using biochemistry and ultrastructural tools. In this way, these analyses should be carried out in toxicological evaluation of reproductive parameters. The adverse effects of glyphosate on the oocytes and follicular cells shown here represent a major risk for the reproduction of fish