Mecanismos neuroquímicos associados à ação antidepressiva e neuroprotetora da lectina isolada das sementes de Canavalia brasiliensis (ConBr)

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014.As lectinas são proteínas que reconhecem e se ligam reversivelmente a carboidratos ligados a proteínas e lipídeos. ConBr é uma lectina purificado a partir das sementes de Canavalia brasiliensis com afinidade por manose/glucose. Previamente mostramos que ConBr injetada i.c.v. pode produzir uma ação do tipo antidepressiva similar a fluoxetina. ConBr também apresenta efeito neuroprotetor contra a excitotoxicidade glutamatérgica em fatias de hipocampo e em modelo de convulsões induzidas por ácido quinolínico. No presente estudo investigamos o envolvimento do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) e da via L-arginina-óxido nítrico (NO·) na ação tipo antidepressiva de ConBr no teste do nado forçado (TNF). Para esse objetivo, camundongos machos adultos foram pré-tratados com NMDA (0,1 pmol/sítio, i.c.v), D-serina (30 mg/sítio, i.c.v. co-agonista de receptores NMDA), L-arginina (750 mg/kg, i.p. precursor de NO·) e sildenafil (5 mg/kg, i.p. inibidor de fosfodiesterase isoforma 5), os tratamentos bloquearam o efeito antidepressivo de ConBr. Do mesmo modo, a administração de ConBr em uma dose sub-ativa (0,1 µg/sítio, i.c.v.) combinada com doses sub-ativas de antagonistas de receptores NMDA, MK-801 (0,001 mg/kg, i.p.) e cetamina (0,1 mg/kg, i.p.) ou do inibidor da guanilato ciclase solúvel, 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ; 30 pmol/sítio, i.c.v.) foram capazes de produzir um efeito sinérgico do tipo antidepressivo. Esses resultados sugerem que o efeito antidepressivo de ConBr no TNF envolve a inibição do receptor NMDA, a redução de NO· e diminuição da síntese de GMPc. Adicionalmente, realizamos um estudo sistemático de vias de sinalização intracelular reguladas por ConBr e que podem estar associadas com os efeitos antidepressivos e neuroprotetores. ConBr (10 µg/sítio) foi injetada no ventrículo lateral (i.c.v.) de camundongos e os hipocampos foram retirados 0,5, 1, 3, 6, 8, 12, 18 e 24 h após o tratamento para análise por Western Blot e qRT-PCR. Os resultados mostraram que ConBr induziu a ativação das proteínas cinases Akt, ERK1 e PKA, bem como induziu aumento da fosforilação de CREB e da expressão do fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF). Esses dados sugerem que a ativação destas vias poderia estar envolvida nos efeitos neuroprotetores e antidepressivos de ConBr. Por fim, avaliamos o potencial neuroprotetor de ConBr em um modelo de isquemia utilizando culturas organotípicas hipocampais (COH) submetidas a privação de oxigênio e glicose (POG). O tratamento com ConBr (0,1 µg/mL), preveniu a morte celular, reverteu o estresse oxidativo e impediu a redução na fosforilação de Akt e ERK1 induzidos por POG. Em culturas primárias de neurônios hipocampais,utilizando a sonda fluorescente Fluo-4/AM, ConBr bloqueou a entrada de Ca2+ dependente da despolarização por K+. Corroborando com este dado COHs submetidas a POG foram coincubadas com doses sub-ativas de ConBr e nifedipina, um inibidor dos canais de Ca2+ voltagem dependentes (CCDV) do tipo L. Os resultados demonstraram um efeito sinérgico de nifedipina e ConBr na redução da morte celular provocada por POG, sugerindo os CCDV como alvo do mecanismo neuroprotetor do ConBr. Dessa forma, em conjunto os resultados indicam a aplicação de lectinas de plantas como estratégia para neuroproteção e modulação da neuroplasticidade através da regulação de glicoproteínas da superfície celular e regulação da sinalização intracelular.Abstract : Lectins are proteins that recognize and reversibly bind to carbohydrates attached to proteins and lipids. ConBr is a lectin purified from Canavalia brasiliensis seeds that displays high affinity for mannose/glucose. We have previously shown that ConBr produced antidepressant-like effect and blocked hippocampal neurotoxicity induced by quinolinic acid and glutamate. The present study was undertaken to investigate the involvement of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor and the L-arginine-nitric oxide (NO·) pathway in the antidepressant-like action displayed by ConBr in the forced swimming test (FST). Moreover, it was evauated the intracellular signaling pathways regulated by ConBr that could be potentially associated with the antidepressant and neuroprotective effects. Finally, neuroprotective activity of ConBr was analised in a model of ischemia in vitro using organotypic hippocampal cultures (OHCs) submitted to oxygen/glucose deprivation (OGD). With the aim of verifying the involvement of NMDA receptors in the antidepressant-like effect of ConBr (10 µg/site, i.c.v.), a pretreatment with NMDA (0.1 pmol/site, i.c.v.), D-serine (30 µg/site, i.c.v.), L-arginine (750 mg/kg, i.p.) or sildenafil (5 mg/kg, i.p.) was carried out. The results show that all treatments blocked the effect of ConBr. Furthermore, the coadministration of subeffective doses of MK-801 (0.001 mg/kg, i.p.), ketamine (0.1 mg/kg, i.p.) or 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ; 30 pmol/site, i.c.v.) and ConBr (0.1 µg/site, i.c.v.), produced a synergistic antidepressant-like effect in the FST. Taken together, the results suggest that the antidepressant-like effect of ConBr involves NMDA receptor inhibition, reduction in NO· and cGMP synthesis. In order to elucidate intracellular signaling pathways regulated by ConBr that may be potentially associated with the antidepressant and neuroprotective effects previously reported, ConBr (10 µg/site) was injected into the ventricle (i.c.v.) of mice, and the hippocampi were removed 0.5, 1, 3, 6, 8, 12, 18 and 24 h after treatment. Our results indicate that centrally administered ConBr is able to activate the hippocampal neurotrophic pathway PKA/Akt/ERK1-CREB(Ser133)-BDNF, suggesting that these signaling pathways might be involved in the neuroprotective and antidepressant-like effects of ConBr. Finally, the potential neuroprotective activity of ConBr was assessed in OHCs submitted to OGD for 15 min, followed by 24 h of recovery when cell viability and neurochemical parameters were analyzed. In addition, the ability of ConBr to modulate intracellular Ca2+ was evaluated by a Ca2+-sensitive fluorescent dye (Fluo-4/AM) in primary cultures ofhippocampal neurons. Treatment with ConBr (0.1 µg/mL) prevented cell death, mitigated the oxidative stress and prevented the reduction of Akt and ERK1 phosphorylation induced by OGD. Furthermore, ConBr blocked K+-induced Ca2+ entrance in hippocampal neurons. To examine the role of voltage dependent Ca2+ channels (VDCC) in the neuroprotective effect of ConBr, OHCs subjected to OGD were submitted to a coincubation of sub-effectives doses of ConBr and nifedipine, an inhibitor of L-type VDCC. The results showed a synergistic effect of nifedipine plus ConBr counteracting the impairment of cell viability induced by OGD, suggesting VDCC as a target of neuroprotective mechanism of ConBr. These results corroborate with previous data that indicate the application of plant lectins for neuroprotective strategies through the regulation of cell surface glycoproteins and intracellular signaling