Efeitos da hiperglicemia crônica e seus metabólitos, metilglioxal e produtos terminais de glicação, na fisiologia e dinâmica mitocondrial no sistema nervoso central

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2014.O diabetes mellitus (DM) é uma doença metabólica comum, caracterizada por um estado de hiperglicemia persistente, sendo uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Durante um estado de hiperglicemia crônica como ocorre no DM, sabe-se que há o acúmulo de compostos carbonílicos reativos, como o metilglioxal (MG), o qual é o principal precursor de produtos terminais de glicação (AGEs). Os efeitos destes metabólitos gerados em situações de DM no sistema nervoso central (SNC) ainda permanecem desconhecidos, desta forma, neste trabalho foi investigado o efeito da hiperglicemia crônica e seus metabólitos, MG e AGEs, sobre a fisiologia e dinâmica mitocondrial no SNC. Para isso, a hiperglicemia crônica foi induzida em ratos Wistar pela injeção de uma dose única de estreptozotocina (STZ, 55 mg/kg, intraperitonealmente). Os animais com glicemia > 200mg/dL foram considerados hiperglicêmicos, sendo que alguns destes animais foram mantidos nestas condições por 60 dias (grupo STZ) e outros receberam injeção subcutânea de insulina (1,5 UI, 2 vezes ao dia; grupo STZ+INS), para a normalização da glicemia. Animais controle receberam injeção de veículo ao invés de STZ. Foi observado que a hiperglicemia crônica não alterou a dinâmica ou a biogênese mitocondrial em córtex cerebral de ratos. Entretanto, a administração de insulina causou um aumento na expressão de Tfam e no tamanho mitocondrial. Por outro lado, foi observado um grande aumento no número de mitocôndrias no bulbo olfatório de animais do grupo STZ. Com o objetivo de melhor compreender os efeitos dos metabólitos acumulados durante este estado hiperglicêmico crônico, analisou-se os efeitos da exposição ao MG e AGEs na dinâmica e fisiologia mitocondrial em cultura celular de astrócitos. Foi observado que a exposição a AGEs induziu uma reorganização mitocondrial, por reduzir o tamanho e aumentar o número de mitocôndrias em células C6 de astroglioma. Entretanto, esta característica que indica o aumento da fissão mitocondrial não foi acompanhada por uma alteração da proteína de fusão Mfn2 ou da proteína de fissão Drp1. Além disso, outro metabólito relacionado à hiperglicemia, o MG, provocou um aumento no consumo de oxigênio (respiração basal e estado IV) e diminuiu o controle respiratório nas células C6, indicando que este metabólito induziu o desacoplamento da mitocôndria. Em concordância com estes resultados, a exposição a AGEs induziu um redução do potencial demembrana mitocondrial em cultura celular primária de astrócitos corticais de rato, sugerindo que a alteração da dinâmica mitocondrial está intimamente relacionada com o efeito desacoplador do MG. Ainda, o aumento do conteúdo de mitocôndrias despolarizadas não estimulou a autofagia, indicando que organelas disfuncionais, as quais são geradoras de espécies reativas de oxigênio, permaneçam na célula neural. Em conclusão, a hiperglicemia crônica e seus metabólitos alteram a dinâmica e a fisiologia mitocondrial em células neurais. Este fenômeno pode levar a célula à morte e, além disso, contribuir para a maior predisposição que os pacientes diabéticos possuem para o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas.Abstract : Diabetes mellitus (DM) is a common metabolic disease characterized by a state of persistent hyperglycemia. The disorder is one of the leading causes of morbidity and mortality worldwide. It is known that chronic hyperglycemic conditions elicit the accumulation of the reactive carbonyl compound methylglyoxal (MG), which has been involved in the formation of advanced glycation end products (AGE). The impact of these compounds on the central nervous system (CNS) is virtually unknown. Therefore, the effect of chronic hyperglycemia and the related metabolites, MG and AGEs, was here investigated on mitochondrial physiology and dynamics in the CNS. For this, chronic hyperglycemia was induced in Wistar rats by injecting a single dose of streptozotocin (STZ, 55 mg/kg, intraperitoneally). Animals with glycaemia > 200mg/dL were considered hyperglycemic. Some animals were maintained in this condition for 60 days (STZ group), and others received daily injections of insulin (1.5 IU, twice a day; STZ+INS group) in order to normalize blood glucose levels. Controls animals received a single injection of vehicle instead of STZ. It was observed that chronic hyperglycemia did not change mitochondrial dynamics or biogenesis in cerebral cortex of rats. However, insulin administration elicited increased Tfam expression and mitochondrial size. In contrast, a marked increase in mitochondrial number was observed in olfactory bulb preparations from STZ-treated animals. In order to better understand the effect of the accumulating metabolites under this hyperglycemic state, we then analyzed the individual effect of MG and AGEs on mitochondria dynamic or physiology in cultured astrocytes. It was observed that AGEs treatment induced mitochondrial reorganization, by reducing the size and increasing the number of this organelle in C6 astroglioma cells. However, this phenomenon that points to increased mitochondria fission, was accompanied by unchanged content of Mfn2 (fusion protein) and Drp1 (fission protein) proteins. In addition, the other hyperglycemic-linked metabolite, MG, provoked increased oxygen consumption (basal respiration and respiring state IV) and reduced the mitochondrial respiratory control, indicating MG-induced uncoupling of mitochondria. In agreement, AGEs provoked reduced mitochondrial membrane potential on rat primary cortical astrocyte cell culture, suggesting that the altered mitochondrial dynamics is directly related to the MG uncoupling properties.Furthermore, the increased content of uncoupled mitochondria did not stimulate autophagy, indicating that dysfunctional reactive oxygen species-producing organelles are being accumulated in the nerve cell. In conclusion, chronic hyperglycemia and hyperglycemia-linked metabolites (MG and AGEs) disrupts mitochondrial dynamics and physiology in nerve cells. The phenomenon might induce cell death, and therefore, a higher predisposition for neurodegenerative disorders development in patients with DM