Otimização e caracterização química de extrato de amora preta (Rubus fruticosus var. Lochness) e seu efeito sobre a dieta hiperlipídica em ratos mediante análise metabolômica

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2014.A obesidade, a resistência à insulina e a herança genética são os principais fatores associados ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares e a diabetes mellitus tipo 2 (DM2), sendo que os dois primeiros fatores podem ser afetados pelo tipo de alimentação. Os alimentos baseados em plantas e derivados ricos em compostos bioativos podem ser capazes de reduzir o estresse oxidativo e melhorar o perfil lipídico com implicações em melhorias no quadro de patologias relacionadas com vias metabólicas, como é o caso da DM2. A amora preta é um fruto rico em compostos dessa natureza, como antocianinas e flavanols. Estes por sua vez, variam em tipo e quantidade dentro do fruto por razões como, produção agrícola, efeitos ambientais, e/ou, de processos de conservação e extração desses compostos para administração como suplemento na forma de extratos em dietas, causando grande discrepância de resultados em ensaios de bioatividade. A diabetes é caracterizada e monitorada pela taxa de um único metabólito presente na corrente sanguínea, a glicose. No entanto, a obesidade e a diabetes afetam o metabolismo do organismo como um todo, e a medição de limitados compostos para diagnosticar ou monitorá-las, bem como, a eficácia de terapias é basicamente incompleta. Portanto, uma perspectiva mais abrangente de múltiplos metabólitos deve ser tomada. Tal abordagem é comumente referida como metabolômica, a qual permite por exemplo, uma impressão digital do plasma (metabólitos) em caso de um grupo de indivíduos obesos em comparação com um grupo saudável. Depois de impressões digitais, os metabólitos presentes, ou encontrados alterados na comparação podem ser identificados, visando interpretação bioquímica e a descoberta mais precisa e específica dos conjuntos de marcadores desta doença. Os objetivos finais são a melhoria do diagnóstico, prognóstico e monitoramento de terapias. Diante do exposto, esta tese buscou definir a melhor condição de extração de antocianinas e outros flavonóides da amora preta para produção de um extrato através de planejamento de experimentos, e que o extrato seja estável frente ao armazenamento por período controlado de 120 dias à -20 oC. Os resultados apontaram diferente condição ideal de extração dependendo do solvente utilizado. A proporção dos solventes MeOH e EtOH, bem como a temperatura de extração foi de 100 % e 48 oC, assim como, ao considerar um tempo de sonicação de 5 min para MeOH e 30 min para EtOH, a porcentagem de HCl foi de 0,0 e 0,2 %, respectivamente. Para avaliação dos efeitos metabólicos ocasionados pelos compostos bioativos provenientes da amora preta sobre obesidade e DM2, foram utilizados animais de experimentação da raça Sprague Dawle alimentados com dietas controladas, sendo uma delas adicionada de extrato de amora. Para tanto, um extrato foi preparado e caracterizado quanto ao teor da antocianina majoritária (cianidina-3-glicosídeo: 1032,0 ± 2,3 mg L-1) pela técnica de cromatografia líquida (LC-UV e LC-MS/MS). Quanto ao teor de flavanol (epicatequina: 498,6 ± 7,5 mg L-1) um método de extração e separação foi desenvolvido, validado e aplicado para o extrato utilizando a técnica de eletroforese capilar (CE-UV). A avaliação metabolômica foi realizada pela técnica de UPLC-ESI-QToF/MS, onde foram investigados os metabólitos em plasma de ratos tratados por 90 dias com dieta hiperlipídica (grupo Caf) e outro adicionado de extrato de amora preta (CafR) e um grupo controle com dieta padrão (grupo Std). Os perfis metabólicos dos ratos tratados com dieta hiperlipídica foram comparados com os tratados com dieta padrão (Caf vs Std) e os tratados com dieta hiperlipídica adicionada de extrato de amora preta com relação aos de dieta hiperlipídica (CafR vs Caf). Os metabólitos identificados foram lipídeos do subgrupo dos: acil graxos, liso- e glicerofosfolipídeos e esfingolipídeos encontrados alterados nas comparações entre dietas. Independente do gênero, os ratos suplementados com extrato de amora (dieta CafR), apresentaram diminuição percentual em acilcarnitinas (melhora no processo de ß-oxidação lipídica), lisofosfatidilcolinas e esfingolipídeos (perda de massa gorda e melhora no processo de inflamação) e aumento em fosfatidilcolinas (melhora no quadro de obesidade e estresse oxidativo). Por fim, a suplementação com extrato de amora na dieta hiperlipídica parece melhorar o quadro de obesidade e consequentemente protelar o desenvolvimento de DM2.Abstract : Obesity, insulin resistance and genetic heritage are the principal factors associated with the development of cardiovascular diseases and type 2 diabetes mellitus (T2DM), whereby the two first factors can be avoided by having certain food intake habbits. Plant intake and derivates extract when rich in bioactive compounds, have proprieties to reduce the oxida-tive stress and improve in lipid profiles with implications in pathologies related with metabolic pathways, like as T2DM. The blackberry fruit is rich in bioactive compounds, such as anthocyanins and flavanols. The type and quantity of flavonoids in blackberry fruit may vary for reasons as agricultural production, environmental effects, and/or conservation processes and extraction of these compounds for administration as a supplement in diets, causing big discrepancy results in bioactivity assay. The diabetes is characterized and monitored by the rate of one metabo-lite present in the blood, the glucose. However, obesity and diabetes affect the metabolism as a whole, and the measurement of limited com-pounds to diagnose or monitor them, as well as the effectiveness of therapies is essentially incomplete. Therefore, a more comprehensive view of multiple metabolites must be taken. This approach is commonly referred as metabolomics, which enables for example, a fingerprint of the plasma metabolites in the case of an obese group, compared with a healthy group. After fingerprints, present or changed metabolites in the comparison can be identified aiming biochemical interpretation, and the discovery of specific sets of markers of this disease. The ultimate goals are to improve the diagnosis, prognosis and monitoring of therapies. Given the above, the proposal of this thesis was to define the best ex-traction condition of anthocyanins and other flavonoids from blackberry to produce an extract using design of experiments, and if this extract is stable in storage for controlled period (120 days at -20 oC). The results showed different ideal condition of extraction depending on the solvent used. The proportion of the solvents MeOH and EtOH, and the tempera-ture of extraction was 100 % and 48 °C, when considering a sonication time of 5 min for MeOH and 30 min to EtOH, the HCl percentage were 0.0 and 0.2%, respectively. To evaluate the metabolic effects caused by bioactive compounds from blackberry on obesity and T2DM, the Spra-gue Dawley rats were taken with controlled diets, where to one diet was added blackberry extract. To do so, an extract was prepared and charac-terized on content of the majority anthocyanin (cyanidin-3-glucoside: 1032.0 ± 2.3 mg L-1) by liquid chromatography technique (LC-UV and LC-MS/MS). To the flavanol content of (epicatechin: 498.6 ± 7.5 mg L-1) a method of extraction and separation was developed, validated and applied in the extract using capillary electrophoresis (CE-UV). The metabolomics analysis were performed by UPLC-ESI-QToF/MS tech-nique, in which were investigated the metabolites in rats plasma treated for 90 days with high fat diet (Caf group) and another added blackberry extract (CafR group) and a control group with standard diet (Std group). The metabolic profiles of treated rats with high fat diet were compared with standard diet (Std vs Caf) and those treated with high fat diet with added blackberry extract with respect to the high-fat diet (CafR vs Caf). The identified metabolites were lipids the subgroup: fatty acyl, lyso and glycerophospholipids and sphingolipids altered in comparisons between diets. Independently of gender, the rats supplemented with blackberry extract (CafR group) showed percentual decrease in acylcarnitines (im-provement in lipid ß-oxidation process), lysophosphatydilcholines and sphingolipids (loss of fat mass and improvement in the inflammation process) and increase in phosphatidylcholines (improvement in obesity and oxidative stress). Finally, the supplementation of blackberry extract appears to improve the obesity and consequently delay in the develop-ment of T2DM