Bioreconhecimento de DNA minicircular por derivados de aminoácidos imobilizados em suportes monolíticos

Atualmente existem diversas patologias que afetam a sociedade, cujas terapias disponíveis não são adequadas, vitimando uma parte da população. A terapia génica e as vacinas de DNA são uma alternativa promissora que visa a administração de DNA que permite que o organismo expresse dada proteína/informação necessária para o tratamento da doença. Os plasmídeos têm sido o meio de entrega do DNA não viral mais utilizados, contudo são constituídos por genes necessários para a produção e replicação nos respetivos hospedeiros que quando administrados em humanos podem causar respostas inflamatórias e imunitárias. Neste contexto, surge o DNA minicircular (mcDNA) como uma tecnologia altamente promissora visto que é constituído unicamente pelos genes de expressão eucariota, necessários para a expressão do gene terapêutico. O mcDNA é por isso considerado um vetor de DNA mais seguro e está associado a um elevado efeito terapêutico, sendo necessário o desenvolvimento de metodologias eficientes para a sua purificação. Neste projeto foi usada a cromatografia de afinidade com derivados de aminoácidos (agmatina e histamina) como ligandos, para estabelecer um método eficaz de purificação do mcDNA. Para o alcance dos melhores resultados possíveis quando aplicada cromatografia de afinidade é essencial um conhecimento minucioso do tipo de interações que se estabelecem entre a amostra injetada e os derivados de aminoácidos estudados. Neste estudo, verificou-se que para o caso da agmatina estabelecem-se maioritariamente interações eletrostáticas para valores de pH inferiores ao pKa e que estas são intensificadas com a diminuição do pH. Observou-se também uma preferência por parte do monolito para a isoforma sc provavelmente devido à maior exposição das bases que assim permite que se intensifiquem outras interações como interações catião-p e interações por pontes de hidrogénio entre as aminas da agmatina e preferencialmente as guaninas da isoforma sc do mcDNA. Relativamente à histamina, apesar de não se ter conseguido estabelecer uma estratégia de purificação, foi também estudado um possível bioreconhecimento do mcDNA para com este derivado de aminoácido. E observou-se que quando utilizado NaCl há também uma preferência por interações eletrostáticas quando aplicados valores de pH inferiores ao pKa, pois assim o ligando apresenta uma carga global positiva que, por conseguinte, interage fortemente com a carga negativa do DNA conferida pelos grupos fosfato. Relativamente à estratégia de eluição com recurso a sulfato de amónio não foi concretizável visto que não se conseguiu obter seletividade, no entanto esta estratégia é menos interessante do ponto de vista industrial dada a implicação ambiental negativa associada ao sulfato de amónio. Após o estudo das diversas condições definiu-se que o suporte mais promissor para a purificação do mcDNA era o monolito modificado com agmatina, usando como gradiente a estratégia por passos com as seguintes concentrações de NaCl: 0 M, 1,5 M, 2,25 M e 2,7 M em 10 mM de tampão Tris-HCl. A biomolécula de interesse eluiu a 2,7 M de NaCl, no entanto verificou-se uma grande perda desta nos passos anteriores. Contudo, neste tipo de estudo, por vezes é necessário comprometer a recuperação de modo a conseguir a pureza adequada. Desta forma, a estratégia desenvolvida neste trabalho permitiu uma separação eficaz da isoforma sc do mcDNA, embora se tenha comprometido parte da biomolécula de interesse nos passos iniciais. De uma forma sucinta, a utilização do suporte monolítico modificado com agmatina pode ser uma solução para a purificação da isoforma sc do mcDNA para uma posterior aplicação terapêutica.Currently, there are several diseases that deeply affect society, and the available therapies are not adequate, victimizing part of the population. Gene therapy and DNA vaccines are a promising alternative aiming the DNA administration allowing the organism to express a given protein / information necessary to contour the disease. The plasmids have been the most used nonviral DNA delivery system, however these have some sequences required for production in bacteria that, when administrated in humans may cause inflammatory and immune responses. In this context, minicircle (mcDNA) arises as a highly promising technology given that it is solely composed by recombinant eukaryotic gene expression, which is necessary to the expression of the therapeutic gene. The mcDNA is therefore considered a safer vector of DNA and it is associated with a high therapeutic effect, being necessary the development of efficient methodologies for mcDNA purification. In this project, the affinity chromatography was used, exploiting the application of amino acids derivatives as ligands, to establish a suitable method for mcDNA purification. To have the best results when affinity chromatography is applied it is essential to know the kind of interactions established between the injected sample and the studied derivatives amino acides. In the present study it was concluded that in the case of agmatine there are mainly favored eletrostatic interactions with the fosfate groups of the DNA to values of pH lower than pKa and that they are intensified with the decreasing of pH. It was also observed a greater interaction between the agmatine imobilized on the monolith and the supercoiled (sc) isoform probably due to the higher exposure of the bases that allow the occurrence of other interactions, like cation-p and interactions by hidrogen bonds between the amines of agmatine and preferencially the guanines of the sc isoforma of mcDNA. Relativily to histamine, despite not having been able so establish a purification strategy, it was also studied a possible biorecognition of mcDNA with this amino acid derivative. It was also observed that when NaCl is used, eletrostatic interactions are also prevalent when pH values lower than pKa are applied, because in these conditions the ligand presents a global positive charge and consequently, interact strongly with the negative charge provided by the fosfate groups. Relatively to the elution strategy with ammonium sulfate, purification was not achieved since it was not possible to obtain the required selectivity. However, this strategy is less interesting from an industrial point of view due to the negative enviromental implications associated with ammonium sulfate. After this study it was defined that the best support to be used in mcDNA purification was agmatine-monolith, using an elution gradient based on a stepwise gradient with four steps as follows: 0 M NaCl, 1.5 M NaCl, 2.25 M NaCl and 2.7 M in 10 mM of Tris-HCl buffer, pH 6. The biomolecule of interest was eluted at 2,7 M NaCl, however there was a large loss of mcDNA in previous steps. Nevertheless, in this kind of study, sometimes it is necessary to compromisse the recovery in order to achieve the desired purity. Briefly, the application of the monolithic support modified with agmatine can be a solution to the purification of the isoform sc of mcDNA to a therapeutic application